一种新的柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因OTU制造技术

本发明专利技术提供了一种柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因OTU，提供一种新的

【技术实现步骤摘要】
一种新的柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因OTU
本专利技术提供了一种柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因OTU，特别涉及该蛋白在端粒酶活性调节中的作用，该蛋白对于E.tenella端粒酶活性具有正向调节的作用，可能成为控制球虫病的潜在靶点，属于基因工程

技术介绍
鸡球虫病对畜牧业有重要的影响，它正在显著增加全球的经济负担。鸡球虫病大多由于被柔嫩艾美尔球虫感染，它是鸡肠道内最严重的寄生虫疾病。目前球虫病的防控主要依赖抗球虫药和疫苗的使用，但由于药物的残留和耐药性问题已经严重影响了食品安全和公共卫生，以及对球虫的细胞和分子生物学特性了解不足，迄今尚无理想的防控措施。因此，寻找理想的药物和疫苗靶标成为当前研究的重点。目前，柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)端粒酶逆转录酶(telomerasereversetranscriptase,TERT)序列已被报道，但对其调控蛋白了解甚少。端粒酶相关蛋白的研究为寻找新的抗球虫的药物和疫苗作用靶标以及深入研究球虫的细胞和分子生物学特性等提供重要线索。目前，关于TERT及相关蛋白研究主要集中在哺乳动物，寄生虫中研究报道很少。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新的柔嫩艾美尔球虫TERT互作蛋白基因OTU(ovariantumour)，该基因编码的蛋白对于E.tenella端粒酶活性具有正向调节的作用，它的发现为深入研究细胞分子生物特性及寻找新的药物疫苗靶标等提供了新的线索。本专利技术所述的一种柔嫩艾美尔球虫TERT及其相关蛋白基因OTU，如SEQNO1，SEQNO2所示。该基因编码的蛋白是利用酵母双杂交的方法通过TERT蛋白对E.tenella的cDNA文库进行筛选，获得与TERT有相互作用的蛋白，并通过酵母回复试验和pull-down的方法进行阳性验证，从而确定在E.tenella中端粒酶蛋白的互作蛋白OTU。利用E.tenella病毒载体介导的核酶干扰OTU基因在球虫体内的表达，从而研究OTU蛋白在E.tenella体内的功能。本专利技术所述的一种柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因的制备方法，包括以下步骤：(1)含有TERT基因的重组诱饵质粒的构建：从E.tenellacDNA中通过PCR获得TERT序列，回收目的片段并进行双酶切，与酶切后的pGBKT7载体连接，并转入大肠杆菌中扩增，通过质粒双酶切以及测序鉴定获得阳性克隆，即为可表达融合蛋白的重组质粒；(2)将重组诱饵质粒转化入酵母菌株，并进行毒性及自激活鉴定；(3)用酵母双杂交的方法筛选E.tenellacDNA文库中与TRBD(RNAbindingdomainoftelomerasereversetranscriptase)相互作用的候选蛋白；(4)用pull-down和酵母回复的方法进一步验证其互相作用，从而确定其为E.tenellaTERT相互作用的蛋白。将TERT蛋白和候选蛋白分别构建到pET-32a和pGEX-4T载体上，在低温条件下，在BL21(DE3)感受态中对可溶性蛋白进行诱导表达及纯化。将纯化的候选蛋白加入Glutathione-Sepharose4B琼脂糖凝胶，4°孵育过夜后，把结合有候选蛋白的琼脂糖凝胶珠子加入TERT蛋白，最后通过Westernblot检测分析阳性互作的结果；(5)设计合成针对互作蛋白基因的的锤头状核酶并连接到E.tenella病毒载体上，用体外转录试剂盒进行体外转录，获得其体外转录本，用荧光定量PCR方法在体内和体外分别分析了病毒载体介导的锤头状核酶对该基因mRNA切割效率；(6)TRAP法检测转染株端粒酶活性。本专利技术的积极效果在于：提供一种新的E.tenellaTERT互作蛋白基因OTU，并确定了其功能，为今后寻找新的药物疫苗靶标及深入研究球虫的细胞分子生物特性等提供了新的线索。本专利技术通过酵母双杂交筛选和验证获得一个新的阳性互作蛋白，并且对其功能进行探讨，该方法具有实用性，高效性的特点。E.tenella病毒转染载体介导核酶为研究球虫基因对虫体影响以及调控提供了一种简易的方法。附图说明附图1为重组诱饵蛋白对酵母菌毒性及自激活作用的检测；附图2为α-半乳糖苷酶试验检测TRBD与候选蛋白相互作用；附图3为pull-down验证TRBD与OTU间相互作用；附图4为E.tenella病毒载体介导的锤头状核酶对OTU-sub体外切割效果检测；附图5为GFP在E.tenella中的表达情况；附图6为流式细胞术检测和分选GFP-Ham-OTU株；附图7A、图7B为Westernblot鉴定OTU表达水平变化；附图8为TRAP检测各虫株中端粒酶活性的变化。具体实施方式为进一步说明本专利技术在柔嫩艾美尔球虫TERT蛋白中的应用，以TERTRNA结合域(TRBD)为实施例进行说明。实施例1：E.tenellaTRBD诱饵表达质粒的构建一、材料Trizol(Invitrogen)；反转录酶试剂盒(Tiangen)；T4DNA连接酶、ExTaq、dNTPs、pMD18-T、EcoRI、BamHI(TaKaRa)。二、方法与结果1E.tenella孢子化卵囊总RNA提取1.1器皿的处理：将研钵、研杵洗涤干净后，浸泡在0.1％DEPC-H2O中过夜。随后用锡纸包好，180℃干烤3h备用；1.2收集的E.tenella孢子化卵囊冰上研磨20min，加入1mLTrizol，室温裂解5min；1.3加入200μL氯仿，混匀，室温放置15min，12000g、4℃离心15min；1.4吸取上层约600μLRNA转移至新的离心管，加入500μL异丙醇，混匀，室温放置15min，12000g、4℃离心15min；1.5去上清，沉淀用75％乙醇洗涤，12000g，4℃离心15min；1.6去上清，离心管放入超净台内风干5min。RNase-freeddH2O溶解沉淀。琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量。2E.tenellacDNA的合成8μLRNA和1μLOligodTprimer(50uM)以及1uLdNTPs(10mMeach)混匀，65℃水浴5min，随后置于冰上2min。加入下列混合物：30℃10min，42℃水浴1h，95℃5min灭活反转录酶。3pGBKT7-TRBD质粒的构建3.1PCR扩增目的基因：根据目的基因设计特异引物，并在上下游引物中分别添加了EcoRI和BamHI酶切位点。下游F-TRBD-BK5’-GGGGAATTCATTACAAGTACTAGAGTAGTAAATT-3’(斜体为EcoRI酶切位点),下游R-TRBD-BK5’-GGGGGATCCTCCTTTTAAACTTTCTAGATAC-3’(斜体为BamHI酶切位点)。引物由长春库美生物技术服务公司合成。以cDNA为模板，进行PCR，PCR体系如下：反应参数为：95℃5min；94℃30sec，57℃30sec，72℃30sec，28cycles；72℃10min。实施例2：重组诱饵蛋白对酵母菌株毒性及自激活作用的检测一、材料X-α-GAL、鲑鱼精DNA(Sigma)；酵母氮源(Biosharp)；c-Myc(Epitomics)；ECL化学发光试剂盒(Thermo)；酵母质粒小提试剂盒(Tiangen)。二、方法与结果1Y187酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种柔嫩艾美尔球虫TERT及其相关蛋白基因OTU，其特征在于：基因序列如SEQ NO1，SEQ NO2所示。

【技术特征摘要】
1.一种柔嫩艾美尔球虫TERT及其相关蛋白基因OTU，其特征在于：基因序列如SEQNO1，SEQNO2所示。2.权利要求1所述的柔嫩艾美尔球虫TERT及其相关蛋白基因OTU，其特征在于：该基因编码的蛋白是利用酵母双杂交的方法通过TERT蛋白对E.tenella的cDNA文库进行筛选，获得与TERT有相互作用的蛋白，并通过酵母回复试验和pull-down的方法进行阳性验证，从而确定在E.tenella中端粒酶蛋白的互作蛋白OUT；利用E.tenella病毒载体介导的核酶干扰OTU基因在球虫体内的表达，从而研究OTU蛋白在E.tenella体内的功能。3.如权利要求1所述的一种柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因的制备方法，包括以下步骤：1）含有TERT基因的重组诱饵质粒的构建：从E.tenellacDNA中通过PCR获得TERT序列，回收目的片段并进行双酶切，与酶切后的pGBKT7载体连接，并转入大肠杆菌中扩增，通过质粒双酶切以及测序鉴定获得阳性克隆，即为可表达融合蛋白的重组质粒；2）将重组诱饵质粒转化入酵母菌株，并进行毒性及自激活鉴定；3）用酵母双杂交的方法筛选E.tenellacDNA文库中与TRBD相互作用...

【专利技术属性】
技术研发人员：张西臣，王璞，梅娜，宫鹏涛，李建华，王旭，杨举，李赫，杨正涛，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22