外表面蛋白质及其基因和用途制造技术

本发明专利技术涉及外表面蛋白质及其基因和用途。根据本发明专利技术，在Ｂ组链球菌中鉴定了一系列基因，其产物可能位于生物体的外表面上。该基因或其功能性片段可用于治疗物质，例如使患者免受微生物感染的疫苗的制备。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

该项专利技术是关于外表面蛋白质的鉴定及其基因和用途，尤其是涉及 在免疫治疗和药物筛选上的应用。
技术介绍
B组链球菌(GBS)也被称为无乳链球菌，是各种病的病原体。特别是， GBS可引起早期发作新生期感染该感染通常开始于子宫，导致新生儿严重的败血病和肺炎，如果不 能及时治疗将其致死，即使得到治疗也会有10 - 20%的死亡率。 晚期发作新生期感染该感染多发于嬰儿刚出生至大约3个月期间，可致败血病，90°/。的病 例伴发脑膜炎。其它病灶性感染包括脑膜炎、脓毒性关节炎、脓肿和眼 内炎。成人感染该感染似乎越来越常见且最频繁地发生于刚生育过婴儿的、年长的、 无免疫应答的女性身上。其特征为败血病和病灶性感染，包括脑膜炎、 脓毒性关节炎、脓肿和眼内炎。尿道感染GBSl泉道感染的成因，在妊娠期的所有感染中约占10%。 家畜感染GBS引起奶牛的慢性乳腺炎。导致产奶量下降，因此具有值得注意的 经济重要性。虽然GBS感染可用抗生素治疗，但免疫学的方法是优选的。因此人 们希望找到一种能被用于有治疗效果的疫苗中的免疫原。3专利技术概要本专利技术基于在GBS中的一系列基因的筌定，以及相关的生物体，该 生物体的产物可能与其外表面相关联且因此可被用作免疫治疗的乾.根据本专利技术的一个方面，肽由包括任意的已被筌定为MS4、 MSIO、 MSll、 MS14和MS16的可得自GBS的基因，或其同源物或功能性片段的操 纵子所编码。此种肽适合用于治疗，例如当被分离后。此处所用的术语功能性片段是指一部分保留整个基因或肽活性 的基因或肽。例如肽的功能性片段可用做抗原决定因子，在疫苗或抗体 生产方面颇有用处.基因片段可用于编码活性肽，另外，该基因片段在基因疗法、体内 野生型基因定位来发挥治疗作用方面有实用.本专利技术的肽可包含确定的任一氨基酸序列，如SEQ IDN0S.2、 4、 6、 8、 10和12，或包含上述序列的功能性片段。因为位于细胞外或细胞表面的位置，本专利技术的肽可为生产抗GBS治 疗上有效的疫苗的候选物.治疗上有效的是指包括疫苗的预防作用。 例如，疫苗可包含本专利技术所述的肽或用于其表达的工具以治疗感染。这种疫苗可在妇女怀孕前或怀孕期间给药来保护母亲和新生儿免受 GBS感染.根据本专利技术的另一方面，此肽或基因可用于筛选潜在的抗微生物药 物或毒性检测.本专利技术的另一个方面是在此处鉴定的任意产物的用途，用于与GBS 菌抹感染相关病症的治疗或预防。虽然已经描述了此蛋白质用于病人的治疗，但该产物的兽医用途也 被视为在本专利技术的范围之内。尤其是，该肽或疫苗可被用于慢性乳腺炎 的治疗，特别是对奶牛的治疗。专利技术描述本专利技术与B组链球菌菌抹M732有关，然而所有的GBS菌抹和许多其 它的细菌菌抹都可能包含相关的肽或蛋白质，它们都有与M732的肽同源的氨基酸序列。可能含有此肽的生物体，包括但不仅限于此肺炎链球 菌，酿脓链球菌，猪链球菌，米氏链球菌，C组和G组链球菌，还有肠球 菌。按照描述GBS的相同方法，可以开发出这些菌抹中的相应疫苗.优逸地，用于生产疫苗的欣与在此筌定的肽有超过40%的序列相似 性，优选可以超过60%,最优选可多于80%的序列相似性，例如95%相似 性，在筌定出本专利技术的一个基因后，可以用此基因序列在别的微生物中 确定同源性。以此方式还可以确定别的微生物是否有相似的外表面产物. 通it^现存的数据库例如EMBL或Genbank中搜索，可以确t亭列的同 源性。本专利技术的肽或蛋白质可通过本领域已知的方法被纯化和分离。特别 是，确定基因序列后，可以用重组技术在合适的宿主中表达基因.活性 片段和同源物可以被鉴定出来，并在治疗领域中应用。例如，肽或其活 性片段可在疫苗中作为抗原决定簇，来引起免疫答应。其也可以被用于 抗体的制备，用于被动免疫或诊断应用.合适的抗体包括单克隆抗体或 其片段，包括单链fv片段。制备抗体的方法对本领域的技术人员来说是 显而易见的。基于减毒微生物的疫苗的制备是本领域技术人员已知的。如需要或 希望的话，疫苗组合物可与合适的载体或佐剂如明矾一起配制，并用于 治疗，来提供抗B组链球菌或其它相关微生物的有效免疫作用.疫苗配 剂的制备对本领域的技术人员来说是显而易见的，通常，本专利技术用于治疗的活性成分的合适的量以及合适载体或赋形 剂以及给药途径的选择对本领域的技术人员来说是公知的.这些因素可 根据已知标准选择或确定，诸如所治疗病症的性质/严重性、受治疗者的 类型或健康状况等.本专利技术的产品可按如下方法鉴定将GBS接种于Todd - H—ewitt氏链球菌肉汤培养基中，允许在37C下 培养过夜.细胞被离心收集和用磷酸盐緩冲盐水(PBS)洗涤.将细胞重新悬浮在渗透性緩冲液(2096(W/V)蔗糖，20MmTris - HC1 pH 7.0, 10mMMgCl2) 中，该渗透性緩冲液含有蛋白酶抑制剂(lmM PMSF， IOMM碘乙酸，10mM 1,10-二氮杂菲，1mM胃酶抑素A)和终浓度为4单位/微升变溶菌素， 在37^培养(振荡)2小时。先用高速离心机除去细胞和碎屑，再用超高速离心1小时。所得到 的含有细胞壁蛋白质的上清液用超滤设备加压浓缩(分子量截断值为 10,000).样品对超高水透析后冻干，经过在填充緩冲液中再悬浮，用制备性 两向凝胶电泳分离出蛋白质，电泳后，选一个单独的点用于研究.对该 点进行MR内胰蛋白酶消化.皿状中提取产生的肽，用微内径RP-HPLC 纯化。每隔45秒收集一次级分，与紫外吸收区相应的部分用延时提取-基体辅助激光解吸-飞行时间质谱、(DE-MALDI-TOF-MS)分析.然后 用Nanospray - MS/MS对在空白制剂中未观察到的Jtt行测序。使用此狀序列的信息，设计了简并低聚核苷酸，将其用于聚合酶链 反应(PCR)来扩增位于所筌定的Ji^列之间的DNA片段.PCR扩增反应的结果是产生几个多聚核苷酸片段，其中每一片段按照 制造商的说明书被克隆到pCR 2. 1-TOPO载体(Invitrogen BV,荷兰) 中。每一质粒中的DNA片段通过测序被鉴定，然后如下所述被用于获得 全长基因序列.用已筌定的DNA片段，低聚核苷酸引物被设计用于基因組DNA测序. 这些引物被设计以便从得到的序列向外的方向排序。 一旦阅读，即 可检查获得的序列是否已经到达基因的5'端和3，端。通过检查同源序列 筌定了这些特征的存在，对于5'末端来说，在Shine - Dalgarno共有序 列之前存在AUG起始密码子(或公认的替换物)而对于3'末端来说，存在 翻译终止密码子。根据全长基因的鉴定，引物被设计用于从GBS基因组DNA扩增全长 产物。所用的引物包括限制酶识别位点(在5'末端的Ncol和在3'末端的Eco0109D，允许产物随后克隆到所用的乳球菌表达体系中.用引物进行PCR反应，并把产物克隆到pCR 2.1克隆载体 (Invitrogen)中.在确认克隆片賴:存在后，用限制酶Ncol和Eco01091 切除该亂插入此片段的栽体是pNZ8048的修饰变体(Kuipers， 0. P.等人(1998) J.Biotech 64:15-21)。这种含有乳球菌复制起点、氯霉素抗性标记、 可诱导的乳链菌肽启动子和多克隆位点的载体通过用2个10X本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由任一已被鉴定为ＭＳ４、ＭＳ１１、ＭＳ１４和ＭＳ１６的可获自Ｂ组链球菌的基因所编码的肽，或与其具有至少６０％序列相似性的同源物，或其保持了引发免疫应答的能力的功能性片段。

【技术特征摘要】
GB 1998-12-22 9828346.8;GB 1999-1-20 9901233.8;GB 1. 一种由任一已被鉴定为MS4、MS11、MS14和MS16的可获自B组链球菌的基因所编码的肽，或与其具有至少60％序列相似性的同源物，或其保持了引发免疫应答的能力的功能性片段。2. 权利要求l的肽，其中所述同源物与由鉴定为MS4、 MSll、 MS14 或MS16的可获自B组链球菌的基因所编码的肽具有至少80%的序列相似 性。3. 根据权利要求1的肽，其任一M酸序列为已确定的SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：MJG休斯，JD桑坦格罗，JD莱恩，R菲尔德曼，JC穆尔，P埃弗里斯特，RJ多布森，CJ亨伍德，G杜根，RK威尔逊，
申请(专利权)人：微科学有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]