毒力基因、蛋白及其用途制造技术

本发明专利技术显示了一系列来自脑膜炎奈瑟氏球菌的基因编码的产物涉及毒力。因此鉴定这些基因可以产生减毒微生物。此外，所述基因或其编码产物可用于制备治疗用的疫苗。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及毒力基因和蛋白及其用途。更具体地说，本专利技术涉及从脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)中得到的基因和蛋白质/肽，及其在治疗和筛选药物中的应用。
技术介绍
脑膜炎奈瑟氏球菌是一种引起败血症性休克和细菌性脑膜炎的革兰氏阴性致病菌。在发展中国家这种细菌是细菌性脑膜炎的主要病因，并在非洲和中国引起大规模流行。在英国，脑膜炎奈瑟氏球菌是除道路交通事故外儿童死亡的主要原因。该细菌天然栖居于人鼻咽部，然后进入血流并由此引起严重的败血症或脑膜炎。尽管现有的抗微生物药可以有效地将细菌从机体中清除，脑膜炎球菌性败血症的死亡率仍相当可观。期望提供治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的病症的方法，例如通过免疫。专利技术概述本专利技术是基于发现了脑膜炎奈瑟氏球菌中的毒力基因。根据本专利技术的第一方面，本专利技术的肽是由操纵子编码的，所述操纵子包括权利要求1中鉴定的任何核苷酸序列，或其在革兰氏阴性细菌中的同源物，或其功能片段，用于治疗或诊断。所述肽对于治疗奈瑟氏球菌感染具有许多治疗应用，包括用于预防性应用的疫苗中。根据第二方面，编码上述肽的多核苷酸也可以用于治疗或诊断。根据第三方面，编码所述肽的基因可以用于制备减毒微生物。减毒微生物通常具有破坏在此鉴定的一个或多个基因的表达的突变，从而提供缺乏毒力的菌株。这些微生物也可用于治疗和诊断。根据第四方面，本专利技术的肽、基因和减毒微生物可以用于治疗或预防与奈瑟氏球菌或革兰氏阴性细菌感染有关的病症。专利技术详述本专利技术是基于发现了编码涉及毒力的肽的基因。因此本专利技术的肽和基因可用于制备治疗感染的治疗剂。应该理解治疗还包括预防性治疗，如接种疫苗。此外，尽管本专利技术的产物主要旨在治疗人类患者的感染，认为兽医应用也在本专利技术的范围之内。本专利技术针对脑膜炎奈瑟氏球菌进行描述。然而所有的奈瑟氏球菌菌株和许多其它革兰氏阴性菌株很可能包括与在此鉴定的肽或蛋白具有氨基酸序列同一性或相似性的相关肽或蛋白。可能含有所述肽的微生物包括但不限于沙门氏菌属(Salmonella)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)和耶尔森氏菌属(Yersinia)。为鉴定本专利技术的毒力基因而进行的试验使用了脑膜炎奈瑟氏球菌B株。对A株数据库进行了同源性检索，然而优选B株的蛋白和基因。优选地，可用于本专利技术各方面的肽与在此鉴定的肽具有大于40％的相似性。更优选地，所述肽具有大于60％的序列相似性。最优选地，所述肽具有大于80％的序列相似性，如95％相似性。对于在此鉴定的多核苷酸序列，可用于本专利技术各方面的相关多核苷酸可以与在此鉴定的序列具有大于40％的同一性。更优选地，所述多核苷酸序列具有大于60％的序列同一性。最优选地，所述多核苷酸序列具有大于80％的序列同一性，如95％同一性。术语“相似性”和“同一性”在本领域中是已知的。使用术语“同一性”是指基于在所比较序列中对应相同位点之间相同匹配的序列比较。术语“相似性”指氨基酸序列之间的比较，并且不仅考虑在相应位点的相同氨基酸，还考虑在相应位点的功能相似氨基酸。因而多肽序列之间的相似性除了序列相似性之外还表示功能相似性。基因序列之间的同一性水平和氨基酸序列之间的同一性或相似性水平可以用已知方法计算。关于本专利技术，公众可得到的确定同一性和相似性的基于计算机的方法包括BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul等，J.Molec.Biol.，1990；215403-410)，可从NCBI得到的BLASTX程序，以及Genetics Computer Group，Madison WI的GAP程序。在此提供的相似性和同一性水平，是用GAP程序获得的，用GAP罚为12和GAP长度罚为4来确定氨基酸序列比较，用GAP罚为50和GAP长度罚为3来进行多核苷酸序列比较。通过表征本专利技术的基因，可以使用所述基因序列在其它微生物中搜索相关的基因或肽。这可以通过在现有的数据库如EMBL或GenBank中搜索来进行。本专利技术的肽或蛋白可以用本领域已知的方法进行纯化和分离。特别是，鉴定了基因序列后，可以使用重组技术在合适的宿主中表达所述基因。可以鉴定出活性片段和相关分子并用于治疗。例如，所述肽或其活性片段可以用作疫苗中的抗原决定簇以引发免疫应答。它们还可以用于制备抗体，用于被动免疫或诊断应用。合适的抗体包括单克隆抗体或其片段，包括单链Fv片段。制备抗体的方法对本领域的技术人员是显而易见的。所述肽的活性片段是那些保留肽的生物学功能的片段。例如，当用于引发免疫应答时，所述片段的大小足以使由该片段产生的抗体区分该肽与细菌微生物上的其它肽。通常，片段大小为至少30个核苷酸(10个氨基酸)，优选60个核苷酸(20个氨基酸)，最优选大于90个核苷酸(30个氨基酸)。同时应该理解，除了来自其它微生物的相关分子之外，本专利技术还包括对在此鉴定的肽和多核苷酸所作的不明显改变其生物学功能的修饰。本领域的技术人员很清楚，遗传密码子的简并性可以产生与在此鉴定的多核苷酸具有较小碱基改变的多核苷酸，但仍编码相同的肽。互补多核苷酸也在本专利技术范围之内。还可以预计在氨基酸水平的保守替换，即不同的酸性或碱性氨基酸可以被置换而实质上不丧失功能。基于减毒微生物制备疫苗是本领域技术人员已知的。可以用合适的载体或佐剂如明矾，作为必需或理想成分，来配制疫苗组合物，以提供对抗感染的有效免疫。疫苗制剂的制备对本领域的技术人员是显而易见的。可以制备带有破坏在此鉴定的任何基因表达的突变的减毒微生物。本领域的技术人员知晓破坏特定基因表达的方法。可以使用的技术包括插入失活或基因缺失技术。本专利技术的减毒微生物还可以包含其它基因的额外突变，例如在第二个在此鉴定的基因或微生物生长所需的单独基因中，如aro突变，或对于沙门氏菌来说，在WO-A-96/17951中鉴定的位于SP12区的基因中。还可以将减毒微生物用作递送异源性抗原、治疗性蛋白或核酸(DNA或RNA)的载体系统。在这个技术方案中，用减毒微生物递送异源性抗原、蛋白或核酸至体内的特定部位。可以通过常规技术将异源性抗原、肽或核酸引入减毒微生物，包括使用重组构建体，如载体，其包含表达异源性抗原或治疗性蛋白的多核苷酸，还包括适合的启动子序列。或者，可以将编码异源性抗原或蛋白的基因引入微生物的基因组，并且内源启动子用于控制表达。更普遍地，正如本领域的技术人员所熟知的，可以选择合适量的本专利技术的活性成分以及合适的载体或赋形剂和给药途径用于治疗。可以根据已知的指标如待治疗的病症的性质/严重程度、受治疗者的类型和/或健康情况等选择或确定这些因素。在一个独立的技术方案中，可以将本专利技术的产物用于鉴定潜在有效抗微生物药物或检测毒力的筛选试验中。常规的筛选试验是本领域技术人员熟知的，并可以用本专利技术的产物以适宜的方式作改动。例如，可以将本专利技术的产物用作潜在药物的作用靶，药物使靶失活或与靶结合的能力表示其潜在的抗微生物活性。本专利技术的各种产物还可以用于兽医应用。以下简要概括用于鉴定毒力基因的试验步骤。用特征-标记诱变(STM)(Hensel等，Science，1995；269400-403)鉴定脑膜炎奈瑟氏球菌中引起败血症感染必需的基因。在STM中，用独特的序列标识标本文档来自技高网...

【技术保护点】
由操纵子编码的肽，所述操纵子包括在此鉴定的如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６５，６７，６９，７１，７３，７５，７７，７９，８１，８３，８５，８７，８９，９１，９３，９５，９７，９９，１０１，１０３，１０５，１０７，１０９，１１１，１１３，１１５，１１７，１１９，１２１，１２３，１２５，１２７，１２９，１３１，１３３，１３５，１３７，１３９，１４１，１４３，１４５，１４７，１４９，１５１，１５３，１５５，１５７，１５９，１６１，１６３，１６５，１６７，１６９，１７１，１７３，１７５，１７７，１７９，１８１，１８３，１８５，１８７，１８９，１９１，１９３，１９５，１９７，１９９，２０１，２０３，２０５，２０７所示的脑膜炎奈瑟氏球菌的任何核苷酸序列，或革兰氏阴性细菌中在肽或核苷酸水平具有至少４０％序列相似性或同一性的相关分子，或其功能片段，用于治疗或诊断应用。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：C唐，
申请(专利权)人：微科学有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]