毒力基因和蛋白质及其用途制造技术

一种用于治疗用途的由操纵子编码的肽、或其在革兰氏阴性菌中在氨基酸或核苷酸水平上至少具有３０％同源性的同源物或其功能片段，其中所述的操纵子包括可获自大肠杆菌Ｋ１的本文鉴定为ｍｄｏＧ、ｃｒｅＣ、ｒｅｃＧ、ｙｇｇＮ、ｅｃｋ１、ｉｒｏＤ、ｉｒｏＣ、ｉｒｏＥ、ｍｔｄ２和ｍｓ１－１６在内的任意基因。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及毒力基因和蛋白质的鉴定及其用途。更具体地说，本专利技术涉及它们在治疗和筛选药物中的用途。
技术介绍
大肠杆菌属于肠杆菌科或肠道细菌，它们是聚居在动物肠道中的革兰氏阴性微生物。该细菌科中的其它细菌包括肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属和耶尔森氏菌属。尽管通常在人胃肠道中发现大肠杆菌，但是它与包括败血病、脑膜炎、尿道感染、伤口感染、脓肿形成、腹膜炎和胆管炎在内的人体疾病有关。由大肠杆菌导致的疾病取决于某些毒力决定簇。例如，大肠杆菌与新生儿脑膜炎有关并已将主要的毒力决定簇鉴定为K1抗原，它是唾液酸的均聚物。K1抗原可以在回避宿主免疫系统和防止吞噬作用方面起作用。专利技术概要本专利技术以一系列大肠杆菌K1中的毒力基因的鉴定以及相关的生物体为基础，其产物可能与生物体的致病性有关。本专利技术的一个方面是一种由操纵子编码的肽、或其在革兰氏阴性菌中的同源物或其功能片段，其中所述的操纵子包括来自大肠杆菌K1的本文鉴定为mdoG、creC、recG、yggN、tatA、tatB、tatC、tatE、eck1、iroD、iroC、iroE、mtd2和ms1-16在内的任意基因。例如，这类肽在分离时适合于治疗用途。本文所用的术语“功能片段”指的是保留与完整基因或肽类似的治疗用途的一部分基因或肽。例如，可以将所述肽的功能片段用作在疫苗或生产抗体过程中有用的抗原决定簇。可以将基因片段用于编码活性肽。另一方面，该基因片段可能在基因疗法中有用，从而靶向体内的野生型基因以便发挥治疗作用。本专利技术的肽可以包括本文鉴定为SEQ ID NOS.2、5、7、9、11、12、13、14、16、23、24、25、26、28、31、29、32和35-48的任意氨基酸序列。将这些肽类鉴定为毒力决定簇使得能够将它们以许多方式用于治疗感染。例如，可以将宿主转化以表达本专利技术的肽或将所述宿主进行修饰以便破坏编码所述肽的基因的表达。一种疫苗还可以包括用于治疗感染的本专利技术的肽或用于其表达的工具。此外，疫苗可以包括具有毒力基因缺失的微生物，其中所述的基因编码本专利技术的肽。根据本专利技术的另一个方面，可以将所述肽类或基因用于筛选有潜能的抗微生物药或用于检测毒性。本专利技术的另一个方面是本文所鉴定的任意产物在治疗或预防与革兰氏阴性菌、特别是大肠杆菌导致的感染有关的疾病中的用途。专利技术描述本专利技术利用了特征标记的诱变(STM)(Hensel等《科学》(Science)1995；269400-403)以便筛选减毒突变体的大肠杆菌K1菌株RS228(Pluschke等《感染与免疫》(Infection and Immunity)39599-608)小Tn5突变体库，从而鉴定了大肠杆菌的毒力基因(和毒力决定簇)。尽管将大肠杆菌K1用作鉴定毒力基因的微生物，但是也将其它肠道细菌中的相应基因看作属于本专利技术的范围。例如，以序列同源性为基础，可以在肠杆菌属、克雷伯氏菌属和包括沙门氏菌属、志贺氏菌属和耶尔森氏菌属在内的与人体肠道疾病相关的其它属中发现相应的基因或编码的蛋白质。本文所用的术语“毒力决定簇”指的是一种产物，例如一种可能起维持病原菌作用的肽或蛋白质。特别地，毒力决定簇是一种与感染性或导致疾病的微生物有关的细菌蛋白质或肽。可以将编码毒力决定簇的基因称作“毒力基因”。通过突变、缺失或插入破坏毒力基因会导致细菌在宿主中的存活率降低或通常导致微生物致病性的降低。已经证实特征标记的诱变是一种用于鉴定毒力基因及其产物的极为有用的技术。该项技术依赖于转座子在允许条件下随机插入微生物基因组中的能力。将转座子分别标记以便于鉴定且然后分别引入微生物，从而使基因组受到破坏。接着通过阴性选择来检测毒力降低的突变型微生物并对已经发生插入失活的基因进行鉴定和特征记述。STM过程中的第一个阶段是制备合适的转座子或转座子样元件。制备不同转座子文库，将它们各自引入载体或质粒以促进其转入微生物。本领域技术人员显然可以制备带有合适转座子的载体且这项技术进一步公开在WO-A-96/17951中。对于革兰氏阴性菌例如大肠杆菌来说，合适的转座子包括Tn5和Tn10。在制备了转座子后，则对细菌菌株进行诱变以便建立各突变型细菌的文库。接着将收集的突变型微生物引入合适的宿主。在适当长的时间后，从宿主中回收微生物并鉴定已经在宿主中存活的那些微生物，由此还鉴定了不能存活的突变型菌株即减毒株。然后将储存文库中相应的减毒株用于鉴定发生插入失活的基因。通常，通过分离位于转座子插入位点侧翼的DNA来鉴定转座子插入的位点且这使得对与毒力相关的基因进行特征记述成为可能。一旦鉴定了无毒性微生物，则能够通过用致死剂量的突变体感染合适的宿主动物而更充分地确定突变型基因在毒力中的潜在作用。将受感染动物的存活时间与用野生型菌株感染的对照组动物的存活时间进行比较且一般可以认为存活期限比对照组动物长的那些动物感染了带有突变型毒力基因的微生物。另一方面，通过用野生型和突变体细菌的混合物感染动物宿主可以研究毒力中的潜在作用。在合适的时间期限后，从宿主动物的器官中收集细菌并测定野生型和突变体细菌的比例。将该比例除以接种物中突变体与野生型细菌的比例来确定竞争指数(CI)。可以认为具有竞争指数小于1的突变体是无毒性的。有可能通过插入转座子而失活的基因可能不是真正的毒力基因，但是可以对下游(毒力)基因具有极性作用。这可以通过进一步的实验来确定，所述的实验过程包括使非极性突变置于基因的更为确定的区域或使其它邻近基因发生突变并确定该突变体是否是无毒性的。由于对大肠杆菌中的毒力基因进行了特征记述，所以有可能使用用来确定其它微生物中同源性的基因序列。以这种方式，有可能确定其它微生物是否具有相似的毒力决定簇。通过检索例如EMBL或Genbank这样的现存的数据库可以确定序列同源性。通常使毒力基因在称作致病性岛的不同染色体区中彼此群集。当致病性岛通常位于重复序列、插入元件或tRNA基因侧翼时，可以识别它们。另外，G+C含量一般不同于染色体的剩余物，这提示它们通过从另一种生物体中的水平传递而获得。例如，大肠杆菌K12的G+C含量为52％。在大肠杆菌菌株中发现的任意致病性岛可能具有不同于该平均值的G+C含量。经鉴定的毒力基因能够用于生产减毒的疫苗菌株和作为抗微生物药的靶物。一般来说，这对于革兰氏阴性菌中的同源物来说同样确切。为了本专利技术的目的，同源性的适当程度一般至少为30％，优选至少为50％、60％或70％，且更优选至少为80％或90％(在氨基酸或核苷酸水平上)。通过本领域中已知的方法可以纯化和分离本专利技术的蛋白质。特别地，由于鉴定了基因序列，所以有可能使用重组技术在合适的宿主中表达基因。可以鉴定活性片段和同源物并可以将它们用于治疗中。例如，可以将蛋白质或其活性片段用作疫苗中的抗原决定簇以便引起免疫反应。还可以将它们用于制备被动免疫用抗体或用于诊断应用。合适的抗体包括单克隆抗体或包括单链fv片段在内的其片段。抗体的制备方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。以减毒微生物为基础的疫苗制品对本领域技术人员来说是已知的。如果必要或需要，可以用例如明矾这样的合适的载体或佐剂来配制疫苗组合物并可以将它们用于治疗，从而提供对大肠杆菌或其它革兰氏阴性菌的有效免疫接种。疫苗制品的制备方法对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：H·R·克鲁克，E·E·克拉克，P·H·艾沃莱斯特，G·杜甘，D·W·霍尔登，J·E·施艾，R·G·菲尔德曼，
申请(专利权)人：微科学有限公司，
类型：发明
国别省市：