本发明专利技术涉及蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白家族iLovU，其包括五种突变体蛋白，其分别通过在野生型黄素蛋白iLov 486位氨基酸位点特异性插入3-氯代酪氨酸、3，5-二氯代酪氨酸、3，5-二氟代酪氨酸、2，3，5-三氟代酪氨酸或2，3，5，6-四氟代酪氨酸(这五种酪氨酸类似物作为光致电子转移探针)而得到。本发明专利技术还涉及两种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：11或13所示。这两种氨酰基-tRNA合成酶突变体能够分别在翻译的氨基酸序列中插入3，5-二氯代酪氨酸或2，3，5，6-四氟代酪氨酸。
【技术实现步骤摘要】
酪氨酸类似物翻译系统和基因编码的蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白家族
本专利技术属于生物化学领域。具体地，本专利技术提供两种酪氨酸类似物翻译系统和基因编码的蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白家族iLovU。更具体地，本专利技术通过基因编码的方法在黄素蛋白iLov中定点特异性插入五种酪氨酸类似物：3-氯代酪氨酸(ClY)、3，5-二氯代酪氨酸(Cl2Y)、3，5-二氟代酪氨酸(F2Y)、2，3，5-三氟代酪氨酸(F3Y)、2，3，5，6-四氟代酪氨酸(F4Y)(该五种酪氨酸类似物简称为ClnY/FnY)作为光致电子转移探针，得到的突变蛋白即为光致电子转移荧光传感器。本专利技术还涉及两种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其氨基酸序列分别如SEQIDNO：11和13所示。这种氨酰基-tRNA合成酶突变体能够用3，5-二氯代酪氨酸/2，3，5，6-四氟代酪氨酸优先氨酰化与之配对的正交tRNA，从而在翻译的氨基酸序列中插入3，5-二氯代酪氨酸/2，3，5，6-四氟代酪氨酸。
技术介绍
基因编码和荧光蛋白(fluorescentprotein，简称FP)传感器是生物学研究中的重要技术手段。在过去的几十年中，人们已经开发出多种荧光蛋白传感器，用于监测金属离子，pH值，第二信使和翻译后修饰(PTM)，这对于解开它们在体内信号转导网络中的作用是至关重要的。这些荧光蛋白传感器通常依赖于荧光共振能量转移(FRET)或者绿色荧光蛋白GFP荧光团酚基的质子化/去质子化来发挥作用。尽管它们现在已被广泛应用，但是在分析物结合前后，这些荧光蛋白传感器的荧光强度变化通常都在两倍以内。相比之下，光致电子转移(photo-inducedelectrontransfer，简称PET)机制开始越来越广泛地被引用到荧光传感器设计中来，最重要的原因在于分析物结合前后，荧光蛋白传感器可以展现出显著的荧光强度变化(通常可以增强10至100倍)。蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白的设计通常使用荧光发光体-连接体-接受体的分子结构形式。在配体结合之前，传感器处于关闭状态，光激发致使受体和荧光基团之间产生电子转移，削弱光能，最终导致荧光淬灭。而当配体结合之后，传感器转变为开启状态，受体分子由于配体的结合可以显著增加HOMO能量，阻断光致电子转移，从而使荧光基团发射光子，产生荧光。基于这种原理，科学家在光致电子转移荧光传感器的设计中通常选择一些相对简单的分析物来进行传感器的开启，如H+，Na+，Ca2+，Zn2+，Cd2+，Pd2+，Hg2+，F-和神经元电压等。这些传感器现已广泛应用于临床，细胞生物学研究以及环境监测中。为了开发基因编码的蛋白质光致电子转移传感器蛋白，我们首先需要在蛋白中遗传整合非天然氨基酸(UAAs)。本研究现已开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地定点插入蛋白的通用方法。这些方法依赖于正交蛋白翻译组分，所述组分识别合适的选择密码子(selectorcodon)从而能在体内多肽翻译期间将所需的非天然氨基酸插入限定位置。这些方法利用识别选择密码子的正交tRNA(O-tRNA)，而相应的特异性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加载该O-tRNA。这些组分不与宿主生物体内的任何内源性tRNA、氨酰基-tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密码子交叉反应(即，它必须是正交的)。利用这种正交tRNA-RS配对可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。本领域普遍知道利用适合于制备含一个或多个非天然氨基酸的蛋白的正交翻译系统，例如产生正交翻译系统的通用方法。例如，参见国际公布号WO2002/086075，其专利技术名称为“METHODSANDCOMPOSITIONFORTHEPRODUCTIONOFORTHOGONALtRNA-AMINOACYL-tRNASYNTHETASEPAIRS”；WO2002/085923，其专利技术名称为“INVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDS”；WO2004/094593，其专利技术名称为“EXPANDINGTHEEUKARYOTICGENETICCODE”。定点特异插入非天然氨基酸的正交翻译系统及它们的产生和使用方法的其他讨论还可参见Wang和Schultz，Chem.Commun.(Camb)1：1-11(2002)；Wang和Schultz，AngewandteChemieInt.Ed.44(1)：34-66(2005)；Xie和Schultz，Methods36(3)：227-238(2005)；Xie和Schultz，Curr.OpinioninChemicalBiology9(6)：548-554(2005)；Wang等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.35：225-249(2006)。
技术实现思路
本专利技术提供基因编码的蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白。通过基因编码的方法在黄素蛋白iLov中定点特异性插入五种酪氨酸类似物：3-氯代酪氨酸(ClY)、3，5-二氯代酪氨酸(Cl2Y)、3，5-二氟代酪氨酸(F2Y)、2，3，5-三氟代酪氨酸(F3Y)、2，3，5，6-四氟代酪氨酸(F4Y)(该五种酪氨酸类似物简称为ClnY/FnY)作为光致电子转移探针，得到的突变蛋白即为蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白。本专利技术还提供两种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其氨基酸序列分别如SEQIDNO：11和13所示。这种氨酰基-tRNA合成酶突变体能够用3，5-二氯代酪氨酸/2，3，5，6-四氟代酪氨酸优先氨酰化与之配对的正交tRNA，从而在翻译的氨基酸序列中插入3，5-二氯代酪氨酸/2，3，5，6-四氟代酪氨酸。这是本专利技术人首次发现的。因此，本专利技术的目的在于利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将五种酪氨酸类似物定点特异插入iLov蛋白中，得到蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白。蛋白质光致电子转移传感器设计的重点主要是在合适的荧光蛋白上定点特异性插入环境敏感型光致电子转移探针。首先，我们选择遗传编码五种酪氨酸类似物：3-氯代酪氨酸(ClY)、3，5-二氯代酪氨酸(Cl2Y)、3，5-二氟代酪氨酸(F2Y)、2，3，5-三氟代酪氨酸(F3Y)、2，3，5，6-四氟代酪氨酸(F4Y)(该五种酪氨酸类似物简称为ClnY/FnY)作为光致电子转移探针，具体原因如下：第一、已有实验证明，酪氨酸阴离子和发光体之间的光致电子转移速率比电中性酪氨酸快百倍。而酪氨酸的pKa为10.2，该值与生理条件的pH值相差较大，因此我们设想，在生理条件下可以用酚基团被取代的酪氨酸类似物来作为最理想的环境敏感型光致电子转移探针。第二、静电场可以严重影响酪氨酸残基的pKa值，因此，带电基团的结合或者神经信号触发的外部静电场变化都能显著干扰非天然氨基酸受体的pKa，最终导致荧光强度的剧烈变化。利用这种特性，我们可以设计出受电荷分析物(例如，ATP、第二信使、核酸)或者活细胞质膜电场调控的蛋白质传感器。第三、酪氨酸的翻译后修饰，如磷酸化，硫酸化和糖基化对于信号转导是至关重要的，而酪氨酸或者酪氨酸类似物酚侧链上氧原子的化学修饰可以显著调节它的光致电子转移供体特性，因此我们可以进一步设本文档来自技高网...
【技术保护点】
SEQ ID NO：11所示的正交氨酰基‑tRNA合成酶，其用3，5‑二氯代酪氨酸优先氨酰化与之配对的正交tRNA，从而在翻译的氨基酸序列中插入3，5‑二氯代酪氨酸。
【技术特征摘要】
1.SEQIDNO：11所示的正交氨酰基-tRNA合成酶，其用3，5-二氯代酪氨酸优先氨酰化与之配对的正交tRNA，从而在翻译的氨基酸序列中插入3，5-二氯代酪氨酸。2.一种表达包含至少一个3，5-二氯代酪氨酸的突变蛋白的3，5-二氯代酪氨酸翻译试剂盒，所述试剂盒包含：(i)3，5-二氯代酪氨酸；(ii)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其为SEQIDNO：9所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3，5-二氯代酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和(iv)编码目标蛋白的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。3.如权利要求2所述的翻译试剂盒，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，所述选择密码子是琥珀密码子。4.一种宿主细胞，其是包含编码权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列和SEQIDNO：9所示的正交tRNA序列的真细菌细胞。5.如权利要求4所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是包含编码权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列和SEQIDNO：9所示的正交tRNA序列的大肠杆菌细胞。6.一种产生在至少一个所选位置定...
【专利技术属性】
技术研发人员：王江云，刘晓红，姜丽，江欢欢，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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