本发明专利技术涉及核酸分子，其编码具有醇脱氢酶活性、特别是甲醇脱氢酶活性的多肽，其包含或具有选自下组的核苷酸序列：(i)如SEQ ID NOs:1(mdh2-MGA3)、3(mdh3-MGA3)或5(mdh2-PB1)中任一项示出的核苷酸序列；(ii)与SEQ ID NOs:1、3或5中任一项示出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性，更特别是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％的序列同一性的核苷酸序列；(iii)与核苷酸序列SEQ ID NOs:1、3或5中的任一条简并的核苷酸序列；(iv)为SEQ ID NOs:1、3或5中的任一项核苷酸序列一部分的或与序列SEQ ID NOs:1、3或5简并的核苷酸序列的一部分的核苷酸序列；(v)编码SEQ ID NOs:2(Mdh2-MGA3)、4(Mdh3-MGA3)或6(Mdh2-PB1)中任一项示出的氨基酸序列的多肽的全部或部分的核苷酸序列；(vi)编码多肽的全部或部分的核苷酸序列，所述多肽具有与SEQ ID NOs:2、4或6中任一项示出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，更特别是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％的序列同一性的氨基酸序列；或者核酸分子，其包含与(i)到(vi)中任一项核苷酸序列互补的核苷酸序列。还提供了包含这种核酸分子和由其编码的多肽的重组构建体、载体和宿主细胞。这种分子可以有利地用于宿主细胞的基因修饰，以例如引入或修饰甲醇脱氢酶活性。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】来自芽孢杆菌的甲醇脱氢酶本专利技术涉及在甲基营养菌中鉴定的以前未知的甲醇脱氢酶(MDH)，特别是涉及在甲醇芽孢杆菌(Bacillusmethanolicus)MGA3和甲醇芽孢杆菌PB1中鉴定的新的MDH编码基因。生化性质不同的这些甲醇芽孢杆菌菌株中存在多个MDH同种型，本专利技术基于该意料之外的发现。编码先前未知的MDH同种型的新基因可以用在宿主微生物的基因工程化中，例如在使用甲醇和/或其它C1化合物作为生长底物的背景中。因此，新的基因/酶可用于引入或修饰，如启用/增强宿主微生物中的MDH活性。甲基营养微生物可以利用一碳(C1)来源，例如甲烷和甲醇作为能量和生物量生成的唯一来源，且甲基营养菌中存在各种不同的酶和C1代谢途径。将在温度高达60℃的甲醇上具有生长能力的革兰氏阳性杆菌分离并归类为甲醇芽孢杆菌。甲醇芽孢杆菌是所谓的受限甲基营养菌，这意味着它可以利用少数多碳来源用于能量和生长。这些生物体的科学兴趣已经主要集中在它们作为在升高的温度下从甲醇工业生产氨基酸、尤其是L-赖氨酸和L-谷氨酸盐的细胞工厂的潜能，但已经提出其作为生产其他有用产品包括维生素、细胞色素、辅酶和重组蛋白的宿主的潜在用途。甲醇芽孢杆菌MGA3(ATCC53907)最初是从Minnesota的土样分离(Schendel,Bremmonetal.(1990)ApplEnvironMicrobiol(应用环境微生物学)56(4):963-970)，它已被用作这种细菌的代谢工程的主要模型菌株(Brautaset,Jakobsenetal.(2007)ApplMicrobiolBiotechnol(应用环境微生物学)74(1):22-34；Jakobsen,Brautasetetal.(2009)ApplEnvironMicrobiol(应用环境微生物学)75(3):652-661；Brautaset,Jakobsenetal.(2010)ApplMicrobiolBiotechnol87(3):951-964)。甲醇芽孢杆菌有几个独特的特点，包括用于甲醇氧化的NAD-依赖性甲醇脱氢酶(MDH)(deVries,Arfmanetal.(1992)JBacteriol174(16):5346-5353；Arfman,Hektoretal.(1997)EurJBiochem(欧洲生物化学)244(2):426-433；Hektor,Kloostermanetal.(2002)JBiolChem277(49):46966-46973)。甲醇脱氢酶(MDH)的活性为甲基营养菌生长的关键属性，并且参与甲醇发酵的第一步骤，即甲醇氧化为甲醛。甲醛是甲醇代谢的中间产物，因此该细胞毒性代谢物的解毒非常重要。甲醛可以通过RuMP途径被同化。已经提出将甲醛直接转化成CO2的另外一种线性异化途径。异化途径被认为对甲醇上生长的细胞的总能量生成是重要的。与RuMP途径一起，异化的途径还可以在调节细胞内甲醛低于毒性水平方面发挥作用。因此，高效的甲醇氧化和伴随的甲醛同化对于生长和能量流进初级代谢和生成所需的产物是至关重要的。此外，所有这一切必须小心地平衡，以确保甲醇有效转化同时避免细胞内甲醛的毒性累积。在这方面，MDH在细菌甲基营养菌中起着至关重要的作用。细菌的MDHs根据它们的反应机理和使用的辅因子(S)可以分为几组。研究最多的是两个亚基的吡咯喹啉醌(PQQ)依赖性醌蛋白MDHs，其广泛存在于革兰氏阴性甲基营养菌中。革兰氏阳性甲基营养菌通常编码NAD(P)+-依赖性甲醇脱氢酶，并且除来自以上讨论的菌株MGA3的MDH外，已经在甲醇芽孢杆菌菌株C1的另一菌株中鉴定出NAD+-依赖性MDH(Vonck,Arfmanetal(1991)JBiolChem266(6):3949-3954；deVries,Arfmanetal.(1992)JBacteriol174(16):5346-5353)。甲醇芽孢杆菌MDH与含铁醇脱氢酶显示主序列相似性，并因此被归类为NAD-依赖性醇脱氢酶的第三家族。这种酶是由10个相同的亚基组成，每个亚基包含一个紧密的但非共价结合的NAD(H)分子，除Zn2+离子和1-2个Mg2+离子外。已发现甲基营养菌中的甲醇芽孢杆菌是质粒依赖性并参与质粒和染色体基因的一致募集。在甲醇芽孢杆菌MGA3中已经鉴定了携带mdh和五个RuMP途径基因的天然质粒pBM19；pBM19的固化导致在甲醇上生长的能力丧失。在导致本专利技术的研究中，且以前没有报道，在生理上非常不同的替代模型菌株PB1(NCIMB13113)中显示一个相应的类似质粒，其被命名为pBM20。已显示NAD依赖性MDH酶可由被分类为nudix水解酶家族中的激活蛋白Act催化激活。甲醇氧化是试图在宿主微生物中工程化甲基营养菌的主要瓶颈。事实上，即使在宿主生物体是天然甲基营养菌如甲醇芽孢杆菌的上下文中，MDH活性或表达的修饰对于改善所需产物的的生长和/或产率是有益的。因此持续需求MDH酶，特别是新型mdh基因，其可用于生物体的遗传工程化，特别是编码相对于本领域的MDH酶具有改变的或者改进的性质的新型酶的基因，例如提高的活性或稳定性，或可以以任何方式有利于用于所需宿主的遗传修饰。为更好地理解甲基营养菌宿主细胞甲醇芽孢杆菌的生理学，本专利技术人对MGA3和可替代的野生型菌株PB1的基因组进行了测序。出人意料的是，在此测序的过程中，已经发现这两种菌株具有多个同种型MDH；在这两种菌株中鉴定出编码三种独立的NAD依赖性MDH蛋白的三个基因。因此，在甲醇芽孢杆菌MGA3中，除了先前报道的编码质粒的mdh-MGA3基因，还鉴定出两个新的基因，这里被称为mdh2-MGA3和mdh3-MGA3。有趣的是，这些新的mdh基因位于染色体上。在甲醇芽孢杆菌PB1中，也已鉴定出三个新的基因，这里称为mdh-PB1、mdh1-PB1和mdh2-PB1，第一个位于质粒(质粒pBM20)且后两个位于染色体。所有这些基因已经被体外重组表达、纯化和进行生化表征。虽然显示一些相似之处，但很显然，这些不同的MDH酶具有不同的特性，包括它们的活性。基于这些研究特别是序列分析，已经鉴定出两种不同的MDH亚家族(sub-family)。第一亚家族包括之前描述的菌株MGA3(mdh-MGA3)的质粒源性mdh基因，以及来自菌株PB1的两个基因mdh-PB1和mdh1-PB1(mdh-PB1是质粒来源的且mdh1-PB1位于染色体)，并在此确定为“mdh/mdh1型家族”。第二亚家族包括新型染色体基因mdh2-MGA3、mdh3-MGA3和mdh2-PB1，且在本文确定为“mdh2/mdh3型家族”。正是后一亚族构成了本专利技术的主题。该mdh2/mdh3型家族的成员相互之间在DNA水平上(参见图1)和所编码的蛋白质的氨基酸序列水平上具有至少90％的序列同一性(参见图2)。特别是，mdh2-MGA3(SEQIDNO.1)和mdh3-MGA3(SEQIDNO.3)的编码序列共享96％的DNA序列同一性，并且编码的多肽Mdh2-MGA3(SEQIDNO.2)和Mdh3-MGA3(SEQIDNO.4)共享96％的氨基酸同一性(参见图2B)。编码的Mdh2-PB1多肽本文档来自技高网...
【技术保护点】
核酸分子，其编码具有醇脱氢酶活性、特别是甲醇脱氢酶活性的多肽，其包含或具有选自下组的核苷酸序列：(i)如SEQ ID NOs:1(mdh2‑MGA3)、3(mdh3‑MGA3)或5(mdh2‑PB1)中任一项示出的核苷酸序列；(ii)与SEQ ID NOs:1、3或5中任一项示出的核苷酸序列具有至少90％序列同一性，更特别是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％的序列同一性的核苷酸序列；(iii)与核苷酸序列SEQ ID NOs:1、3或5中任一序列简并的核苷酸序列；(iv)为SEQ ID NOs:1、3或5中任一条核苷酸序列的一部分或与SEQ ID NOs:1、3或5的序列简并的核苷酸序列的一部分的核苷酸序列；(v)编码SEQ ID NOs:2(mdh2‑MGA3)、4(mdh3‑MGA3)或6(mdh2‑PB1)中任一个示出的氨基酸序列的多肽的全部或部分的核苷酸序列；(vi)编码多肽的全部或部分的核苷酸序列，所述多肽具有与SEQ ID NOs:2、4或6中任一个示出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，更特别是至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％的序列同一性的氨基酸序列；或者核酸分子，其包含与(i)到(vi)中任一项的核苷酸序列互补的核苷酸序列。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.01.25 GB 1201178.91.核酸分子，其编码具有醇脱氢酶活性的多肽，其由选自下组的核苷酸序列组成：(i)对应于mdh2‐MGA3的SEQIDNO:1、对应于mdh3‐MGA3的SEQIDNo:3或对应于mdh2‐PB1的SEQIDNO:5中任一项示出的核苷酸序列；(ii)与核苷酸序列SEQIDNOs:1、3或5中任一序列简并的核苷酸序列；及(iii)编码对应于mdh2‐MGA3的SEQIDNO:2、对应于mdh3‐MGA3的SEQIDNO:4或对应于mdh2‐PB1的SEQIDNO:6中任一个示出的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；或者核酸分子，其由与(i)到(iii)中任一项的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成。2.如权利要求1所述的核酸分子，其编码具有甲醇脱氢酶活性的多肽。3.多肽，其具有醇脱氢酶活性，并且其由SEQIDNOs:2、4或6中任一项示出的氨基酸序列组成。4.如权利要求3所述的多肽，其具有甲醇脱氢酶活性。5.包...
【专利技术属性】
技术研发人员：特吕格弗·布朗特赛特，唐杰·玛丽特·杰克坎·海格斯特，安妮·克罗格，威海姆·约翰内斯·曲克斯，马克·贾恩·雅克布·伯恩哈德·斯巴德，茱莉亚·沃浩特，乔纳斯·米勒，帕特里克·基弗，伊娃·珀特赫夫，沃克尔·F·文德斯彻，伦纳特·莱斯梅尔，史蒂芬妮·海克斯，珍·查尔斯·珀尔泰斯，
申请(专利权)人：森文特公司，格罗宁根大学，苏黎世联邦理工学院，
类型：发明
国别省市：挪威;NO
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