一种整合酶及其在改造刺糖多孢菌中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种新的整合酶及其在刺糖多孢菌遗传改造中的应用。具体地，所述的整合酶来自糖多孢菌CCTCC AA208003(Saccharopolyspora endophytica)，且所述的整合酶通过特定的顺式原件,可在刺糖多孢菌染色体特异性定点整合外源DNA。此外，本发明专利技术人还通过刺糖多孢菌不同菌株遗传因子的研究发现了不同菌株来源的可在刺糖多孢菌内的自主游离复制区。基于本发明专利技术的整合酶以及复制区域序列构建载体可用于刺糖多孢菌的遗传改造，可能发现新型的多杀菌素类似物，也可能提高多杀菌素发酵产量。可通过质粒携带不同的抗性分子标记，用于刺糖多孢菌种间或者属间的基因组shuffling操作，实现高效基因组重排。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程或分子生物学领域，具体涉及可用于刺糖多孢菌遗传改造的 整合酶，其借助质粒载体鉴定系列功能基因，维持质粒载体在刺糖多孢菌中稳定遗传，为刺 糖多孢菌的基因工程改造（核酸序列的功能分析、同源表达、异源表达或过量表达，分子标 记等）及基因组优化提供有效的分子遗传操作工具，快速实现改良刺糖多孢菌及提高多杀 菌素产量。
技术介绍
刺糖多孢菌（Saccharopolysporaspinosa)属于糖多孢菌属，可产生多种新型大 环内酯类化合物A83543(l)。目前，从该类菌发酵液中至少分离到30种结构类似物，依次 命名为SpinosynA,B，C等，其中以SpinosynA和D活性最高（2)。美国陶氏益农公司于 1997年推出以SpinosynA和D为活性物的新型高效生物杀虫剂多杀菌素（Spinosad)。多 杀菌素杀虫谱广，对蜘蛛、线虫、昆虫均有控制作用，特别是对鳞翅目和双翅目害虫有较好 的毒杀作用；该类物质在环境中易降解，对哺乳动物、鸟类以及捕食性昆虫相对低毒，表现 出更好的环境安全性。Spinosyns类物质主要由三部分组成，核心骨架为21碳形成的12元大环内酯， 另加一个鼠李糖和一个福乐胺糖。刺糖多孢菌不同菌株产生这类化合物的比例组分有 所不同，如NRRL18395、18537、18538、18539 主要产生SpinosynA、B、C、D、E、F、G、H和J; NRRL18823 主要合成SpinosynQ、R、S和T;NRRL18719 和NRRL18720 主要产生Spinosyns J组分；NRRL18743 主要合成SpinosynK、0、P、U、V、W和Y。 刺糖多孢菌和红霉素产生菌红色糖多孢菌均属于糖多孢菌属，但是前者的遗传操 作非常困难，通过接合转移或原生质体转化导入质粒的效率很低；刺糖多孢菌染色体没有 完整phiC31整合所需attB，通过识别可能的pseudo-attB识别位点，通用的包含phiC31整 合相关元件的质粒PSET152可以以非常低的效率导入（低于10-7接合转移效率）；通过同 源片段重组可以导入外源基因或增加内源基因的拷贝数，但多限于单交换，会直接影响上 下游基因的功能，所以通常需要选择可能的中性位点，且可能无法稳定遗传。 因此，本领域迫切需要开发一种能够用于高效改造刺糖多孢菌基因的方法及合适 的改造工具。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新的整合酶，借助该整合酶可以实现在刺糖多孢菌内进行外源 基因的定点整合，并不影响原菌株的生长。 在本专利技术第一方面，提供了一种整合酶，在另一优选例中，所述的整合酶来自保藏 号为CCTCCAA208003的糖多抱菌（Saccharopolysporaendophytica)，且所述的整合酶具 有将外源基因进行特异性定点整合的功能。 在另一优选例中，所述特异性定点整合是基于以下定点整合位点的定点整合： GCGGAGGATACGGGATTCGAACCCGTGAGGGCTATTAACCCAACACGATTTCCAAT (SEQ ID NO. :3) 在另一优选例中，所述的特异性定点整合是将外源基因定点整合入刺糖多孢菌染 色体。 在另一优选例中，所述的整合酶的序列如SEQ ID NO. :1所示。 在另一优选例中，所述的整合酶选自下组： (a)将SEQ ID NO. : 1所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加 形成的并具有对刺糖多孢菌染色体进行特异性定点整合的活性的衍生蛋白； (b)序列中含有SEQ ID NO. :1所示的序列的衍生蛋白； (d)氨基酸序列与SEQ ID NO. :1所示序列同源性彡85% (较佳地彡90%， > 95% )，并具有特异性定点整合的功能的衍生蛋白。 本专利技术第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本专利技术第一 方面所述的整合酶。 在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO. : 2所示。 本专利技术第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本专利技术第二方面所述的多核 苷酸。 在另一优选例中，所述的载体还含有： 含SEQ ID NO. : 3所示核苷酸序列的整合位点的协助整合元件；和/或 待定点整合的外源基因。 在另一优选例中，所述的协助整合元件和待定点整合的外源基因可以是毗邻的或 直接相连的。 在另一优选例中，所述的协助整合元件位于所述外源基因的上游和/或下游。 在另一优选例中，所述的载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体，较佳地，所述的 载体为表达载体。 在另一优选例中，所述的载体含有SEQ ID NO. :4所示序列。 在另一优选例中，所述的外源性基因与本专利技术第二方面所述多核苷酸位于相同或 不同质粒中。 在另一优选例中，所述的外源性基因包括外源性标记基因和或外源性功能基因。 在另一优选例中，所述的外源性标记基因包括非内源性刺糖多孢菌的复制因子。 在另一优选例中，所述非内源性刺糖多孢菌的复制因子序列如SEQ ID NO. :5-8所 /Jn〇 在另一优选例中，所述的复制因子来自于刺糖多孢菌野生或突变菌株，较佳地来 自刺糖多孢菌内源性质粒。 在另一优选例中，所述的来自刺糖多孢菌内源性质粒的复制因子核苷酸序列如 SEQ ID NO. : 9 所示。 在另一优选例中，所述的来自刺糖多孢菌内源性质粒的复制因子编码的蛋白包括 SEQ ID NO. :IO-Il0 在另一优选例中，所述的载体携带糖多孢菌复制因子。在另一优选例中，所述的载体是一种双质粒载体系统，所述的系统含有第一质粒 和第二质粒，其中， (i)所述的第一质粒含有本专利技术第二方面所述的的多核苷酸；和 (ii)所述的第二质粒含有外源基因构建物。 在另一优选例中，所示的第一质粒导入宿主细胞后，依赖所表达的本专利技术第一方 面所述的整合酶，实现携带任选的外源性功能基因表达。 在另一优选例中，所述的外源基因的氨基酸序列如SEQIDNO. :10-11所示。 在另一优选例中，所述的载体还具有以下一个或多个特征： (a)不影响刺糖多孢菌的正常生长或代谢； (b)含有一个或多个抗生素抗性基因编码片段； (C)质粒可相互在刺糖多报菌中共存，不影响复制。本专利技术第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本专利技术第三方面所 述的载体或宿主细胞的染色体整合有本专利技术第二方面所述的多核苷酸。 在另一优选例中，所述的宿主细胞为刺糖多孢菌细胞。 在另一优选例中，所述的载体含有SEQIDNO.:3所TK核苷酸序列的整合位点的协 助整合元件；和/或待定点整合的外源基因。 本专利技术第五方面，提供了本专利技术第一方面所述的整合酶或其编码基因或本专利技术第 三方面所述载体的用途，用于制备进行外源基因的定点整合的试剂或试剂盒。 在另一优选例中，所述的外源性基因包括一个或多个外源性标记基因和/或外源 性功能基因。 本专利技术第六方面，提供了一种定点整合方法，包括步骤： 在本专利技术第一方面所述的整合酶存在下，在一外源基因构建物存在下，对一含定 点整合位点的核酸物质进行整合反应，其中，所述的构建物含有待整合的外源基因以及位 于所述外源基因上游和/或下游的协助整合元件，从而将所述外源基因定点整合入所述核 酸物质上的所述定点整合位点。 在另一优选例中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种整合酶，其特征在于，所述的整合酶来自保藏号为CCTCC AA208003的糖多孢菌(Saccharopolyspora endophytica)，且所述的整合酶具有将外源基因进行特异性定点整合的功能。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：覃重军，夏海洋，党福军，陈建，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31