流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位及其变异表位与应用制造技术

本发明专利技术公开了流感病毒胞膜蛋白Ｍ２的中和表位及其变异表位与应用。本发明专利技术所提供的流感病毒胞膜蛋白Ｍ２的中和表位及其变异表位，所述中和表位是具有序列表中序列１的氨基酸残基序列的八肽；所述变异表位选自具有下述氨基酸残基序列的八肽之一：（１）序列表中序列２的氨基酸残基序列；（２）序列表中序列３的氨基酸残基序列；（３）序列表中序列４的氨基酸残基序列。本发明专利技术应用杂交瘤技术得到了针对流感病毒Ｍ２蛋白胞外区的中和表位的单克隆抗体８Ｃ６（亚型ＩｇＧ２ａ）。经单克隆抗体８Ｃ６被动免疫的Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，可以抵抗流感病毒的攻击，单克隆抗体８Ｃ６具有良好的防护性效果，本发明专利技术的流感病毒胞膜蛋白Ｍ２的中和表位及其变异表位将在流感的防治中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗原的表位及其应用，特别涉及流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位及其变异表位与应用。
技术介绍
流感是一种由病毒引起的常见、多发性传染疾病，对人类特别是老人、儿童以及身体较弱的人有很大的威胁。现有的流感疫苗有以下三种(1)流感病毒灭活疫苗，该疫苗目前在成人中广泛使用，是利用流感病毒灭活后的病原体制成的。但是该疫苗株需要随流感病毒株抗原性变异而及时更换，否则免疫效果就无保证，甚至无效。由于流感病毒的变异性很强，所以这种疫苗很难确保其预防效果。(2)流感病毒减毒活疫苗，该疫苗于1960年开始大量用于人体，也是利用流感病毒减毒后的病原体制成的。该疫苗株也需要随流感病毒株抗原性变异而及时更换，目前，国内外正在进行新疫苗株的筛选实验。(3)流感病毒亚单位疫苗，该疫苗是目前国外儿童正在使用的流感疫苗，是利用基因重组的病毒表面抗原诱导免疫防护，病毒表面抗原也需要随流感毒株抗原性变异而及时更换，否则免疫效果就无保证，甚至无效。上述3种正在使用的流感疫苗总的特点是不能对付流感病毒毒株的抗原性变异。流感病毒的变异性很强，抗原性变异不断发生。上述流感疫苗不能对付流感病毒的变异，根本原因是因为上述流感疫苗的设计基本都是基于流感病毒的两个表面胞膜蛋白HA(血凝素)和NA(神经苷酸酶)，国外的大量研究表明，HA和NA的不断变异造成了流感病毒的免疫逃逸，HA和NA的突变率分别为6.7×10-3和3.2×10-3(Annu RevGenet 2002 36 305-332)。目前，比较多的研究转移到流感病毒的第三种表面胞膜蛋白M2，并且已经有大量的工作是将以M2蛋白的整个胞外区序列(aa1-24)，作为流感病毒新型疫苗的设计靶点。这主要是因为M2蛋白相比HA和NA有突出的保守性，并且大量的研究表明M2蛋白的胞外区序列能够诱导非常有效的防护性免疫反应(Nature Medicine 1999，51157-1163；Vaccine 2003，212616-2626；Vaccine 1995，131339-1342)。专利技术创造内容本专利技术的目的是提供流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位及其变异表位。本专利技术所提供的流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位是具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的八肽，名称为LM2；流感病毒胞膜蛋白M2的变异表位选自具有下述氨基酸残基序列的八肽之一(1)序列表中序列2的氨基酸残基序列；(2)序列表中序列3的氨基酸残基序列；(3)序列表中序列4的氨基酸残基序列。其中，85％人流感病毒具有序列表中序列1的中和表位；7.5％人流感病毒具有序列表中序列2的变异表位；7.5％人流感病毒具有序列表中序列3的变异表位；部分能够感染人类的禽流感病毒具有序列表中序列4的变异表位。本专利技术的专利技术人研究发现流感病毒M2蛋白的胞外区氨基酸序列的N端多肽诱导的抗体能够部分的抑制病毒在MDCK细胞中的繁殖(FEMS Immunol Med Micro 2003 35141-146)，被这个N端多肽中的一段八肽EVETPIRN(aa6-13)与载体的耦联物免疫的小鼠中，有50％的小鼠能够防护免受致死剂量病毒的攻击。本专利技术的流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位(流感病毒胞膜蛋白M2胞外区的一段氨基酸序列(aa6-13EVETPIRN))，在所有的人类流感病毒中非常保守(85％的人类流感病毒具备这样的序列)，即使在禽流感中也有突出的保守性，针对流感病毒M2蛋白的序列分析的结果表明，流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位((aa6-13EVETPIRN))序列的变异具有明显的限定性。本专利技术应用杂交瘤技术得到了针对流感病毒M2蛋白胞外区的中和表位EVETPIRN(aa6-13)的单克隆抗体8C6(亚型IgG2a)。实验证明，经单克隆抗体8C6被动免疫的Balb/C小鼠，可以抵抗流感病毒的攻击，单克隆抗体8C6具有良好的防护性效果；同时，本专利技术的流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位及其变异表位与载体蛋白偶联后还可以作为流感疫苗，在流感的防治中发挥重要作用。附图说明图1A为单克隆抗体8C6和流感病毒M2蛋白胞外区的氨基酸序列多肽的ELISA测定曲线图1B为单克隆抗体8C6与流感病毒天然M2蛋白的流式细胞检测识别曲线图2A为连续覆盖流感病毒M2蛋白胞外区24个氨基酸序列的三段多肽与8C6，以及中和表位八肽EVETPIRN(aa6-13)与8C6的ELISA测定曲线图2B为流感病毒M2蛋白胞外区包含或者缺失中和表位八肽EVETPIRN(aa6-13)的GST融合蛋白与8C6的免疫印迹图谱图3为针对图2A和图2B结果的图例式说明图4为8C6被动免疫小鼠血清中针对流感病毒M2蛋白胞外区M2e序列的抗体滴度曲线及柱状5为攻毒后小鼠的体重随攻毒时间的变化曲线图6为攻毒后小鼠的存活率随攻毒时间的变化曲线具体实施方式实施例1、针对流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位的单克隆抗体8C6的制备1、制备具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的中和表位八肽中和表位八肽EVETPIRN(aa6-13)由上海申能博彩生物科技有限公司采用日本岛津PSSM-8型多肽自动合成仪器合成，采用HP 1050型全自动高压液相色谱分析鉴定。2、单克隆抗体8C6的制备动物免疫程序 采用BALB/c小鼠作为免疫动物，以用戊二醛耦联的方法将步骤1中得到的中和表位八肽耦联到BSA上作为免疫原，免疫剂量为50μg(0.1mL)免疫原加等体积完全福氏佐剂乳化，进行首次皮下多点(4点)注射免疫，每点皮下注射50μL。一月后，取同样量免疫抗原加等量不完全福氏佐剂，乳化，进行加强免疫，再过一月后，取同样量免疫抗原不加佐剂腹腔注射进行加强免疫，之后5天采血，测定抗体效价，取脾细胞。细胞融合与克隆化 取免疫BALB/c小鼠脾细胞，按4∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。细胞冻存和复苏 取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1×106-5×106个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。单克隆抗体的制备与纯化 采用体内诱生法，将BALB/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105-106个/只，7-10天后采集腹水。用流感病毒M2蛋白胞外区的氨基酸序列多肽(M2e)特异性的亲和层析柱(Sepharose 4B，Pharmacia Biotech)纯化8C6杂交瘤腹水中(Balb/c)的特异性单克隆抗体，得到单克隆抗体8C6，小瓶分装，-20℃保存。实施例2、鉴定单克隆抗体8C6识别具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的中和表位八肽的特异性1、酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定8C6单抗对流感病毒M2蛋白的识别筛选用的抗原M2e多肽(由美国Genemed Synthesis公司合成，San Francisco，CA，USA)，其氨基酸序列为MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD，将M2e多肽包被在固相的聚苯乙烯ELISA板上(购自Costar)，以实施例1的杂交瘤本文档来自技高网...

【技术保护点】
流感病毒胞膜蛋白Ｍ２的中和表位及其变异表位，所述中和表位是具有序列表中序列１的氨基酸残基序列的八肽；所述变异表位选自具有下述氨基酸残基序列的八肽之一：（１）序列表中序列２的氨基酸残基序列；（２）序列表中序列３的氨基酸残基序列 ；（３）序列表中序列４的氨基酸残基序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈应华，刘万里，陆韵，丁健，邹鹏，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]