一种生物工程技术领域的安全连续封闭式细胞培养、病毒生产／灭活的方法，步骤为：１）接种细胞，悬浮培养，实现细胞的初级培养；２）流加新鲜培养基，同时泵出细胞悬浮液，维持细胞培养生物反应器稳定，保证细胞在反应器中的停留时间内扩增，实现细胞的连续培养；３）泵出细胞悬浮液至含有病毒的病毒增殖反应器，实现病毒在细胞中的初级感染增殖；４）随着细胞悬浮液的流入和含病毒上清液的流出，在维持整个系统动态平衡的过程中实现病毒的连续培养；５）收集从病毒增殖反应器中泵出的病毒上清液，灭活病毒，实现连续封闭培养细胞和灭活病毒。本发明专利技术便于自动化控制，标准化生产，且降低了污染机会和提高了生产安全系数。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物工程
的方法，具体地讲，是一种。
技术介绍
利用细胞来生产病毒，主要有两种方式(1)细胞和病毒种子一同培养，在细胞增殖的过程中，复制病毒，达到大量生产病毒的目的，这是模拟生物体内自然生存状态的一种方法；(2)将细胞和病毒的扩增过程分开，即先大量扩增细胞，达到一定程度后再加入病毒种子，维持细胞的活性，通过子代病毒在细胞间的不断感染和复制，来达到大量生产病毒的目的。随着对病毒研究的不断深入，发现细胞扩增过程和病毒在细胞中增殖过程的最优化培养条件有一定的差异，因此，目前主要采用细胞培养过程和病毒在细胞中增殖过程分开的方法制备病毒。在生产病毒时，大量、高密度细胞的培养是产生高滴度病毒的前提，间歇培养和补料培养不能够充分提供足够的营养物质和及时去除有毒的代谢产物，已逐渐被灌注培养的方法所替代。灌流培养是一种在连续动态监测条件下的培养过程，可及时地按需要加入新鲜培养基同时抽出含细胞代谢产物的消耗性培养基，使细胞始终保持在一种相对稳定，有充足营养的生长环境中生长，在细胞生长速度、细胞密度以及细胞形态方面都有良好的效果，因而适用于高密度细胞培养和大规模病毒生产。经对现有技术的文献检索发现，刘建青等人在《山东医药》2005，45(23)7～8上发表的“固定床生物反应器生产高滴度乙型脑炎病毒”一文中，提出了一种使用Fibra-Cel Disks为载体的固定床培养Vero细胞生产乙型脑炎病毒的方法。首先，用加有10％新生牛血清的199(Gibco)作为细胞扩增培养基进行灌注培养方式大量扩增Vero细胞，高密度培养，达到一定程度后，去除细胞培养液，用加有0.4％人血白蛋白的199(Gibco)作为细胞维持培养基，接种病毒，采用灌注培养方式大量增殖病毒。检索中还发现，Y.Z.Ghendon等人在《Vaccine》2005，234678～4684上发表的“Development of cell culture(MDCK)livecold-adapted(CA)attenuated influenza vaccine”(细胞培养活耐寒减毒流感疫苗的发展，《疫苗》)一文中，提出了一种使用Cytodex-1微载体悬浮培养MDCK细胞生产流感病毒的方法。首先，用Axcevir-MDCK无血清培养基通过灌注培养方式大量扩增MDCK细胞，高密度培养，达到一定程度后，去除细胞培养液，换用加有2μg/mL胰酶的Axcevir-MDCK无血清培养基作为细胞维持液，接种病毒，采用分批培养方式大量增殖病毒。但是上述的两种方法中，细胞培养和病毒增殖两个过程单独来看有连续生产的，但整个过程是间歇和不封闭进行的，是在前一个过程单元结束后才开始下一个过程单元的，不利于大规模、连续性、安全生产病毒疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，针对目前病毒疫苗生产中“不连续性和不封闭性”，本专利技术提供一种，用于细胞培养、病毒增殖、病毒灭活，使其能够降低染菌和病毒外泄的风险，同时整套系统便于自动化控制，能够安全、高效、大规模增殖病毒用于疫苗生产。本专利技术是通过以下技术方案实现的，包含以下步骤1)向细胞培养生物反应器中接种1～2×105cells/mL的细胞，悬浮培养，扩增至0.2～1.0×107cells/mL(对于微载体悬浮培养时，微载体上80～90％汇满细胞)，实现细胞的初级培养；2)根据培养细胞的生长特性和生物反应器体积的大小，以0.3～1.0倍反应器工作体积/天的流速流加新鲜培养基，同时以同样流速泵出细胞悬浮液，维持细胞培养生物反应器稳定的同时，保证细胞在反应器中的停留时间内扩增至0.2～1.0×107cells/mL(对于微载体悬浮培养时，微载体上80～90％汇满细胞)，实现细胞的连续培养；3)泵出细胞悬浮液至含有感染复数为2～10病毒的病毒增殖反应器，实现病毒在细胞中的初级感染增殖；4)随着细胞悬浮液的不断流入和病毒上清液的不断流出，在维持整个系统动态平衡的过程中实现病毒的连续增殖； 5)用病毒收集罐收集从病毒增殖反应器中泵出的病毒上清液，灭活病毒，实现连续封闭培养细胞和灭活病毒。所述的步骤1)中，细胞的初级培养，具体是指采用悬浮培养方式进行细胞培养，培养的细胞可以是技术人员熟知的悬浮的、经悬浮培养驯化的或者贴壁的细胞，如鸡胚成纤维细胞，CHO细胞、MDCK细胞、BHK-21细胞、Vero细胞、293细胞等。针对不同的细胞类型，可以采用技术人员熟知的不同类型的培养基，如补加4％~10％血清的DMEM、Eagle MEM、RPMI1640、199等含血清培养基，或无血清培养基，如NCTC135∶F12(1∶1)，alpha MEM∶F12(1∶1)等的组合。针对不同的细胞类型和悬浮培养要求，可以采用技术人员熟知的不同类型的微载体，如葡聚糖、胶原、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、明胶、玻璃、纤维素、聚乙烯等微载体，用量在2～10g/L之间。温度控制在37±0.2℃，pH维持在7.0～7.2之间，溶解氧(DO)25％～60％。接种密度在1～2×105cells/mL之间，可通过分批、补料或灌注等方式将细胞扩增至0.2～1.0×107cells/mL(对于微载体悬浮培养时，微载体上80～90％汇满细胞)，完成初级培养阶段。优选灌注方式，可实现快速细胞扩增。根据葡萄糖的消耗和乳酸的生成情况，一般在接种后的48～72h后开始灌注培养，按照培养细胞种类的不同选择0.5～1.5倍反应器工作体积/天的灌注速率。所述的步骤2)中，细胞的连续培养，具体是指初级培养细胞密度达到要求后，进入高密度连续培养细胞阶段。首先结束初级灌注培养，然后按照培养细胞的种类，以0.3～1.0反应器工作体积/天的流速调节流加新鲜培养基(若是微载体培养，培养基中含新鲜微载体)，并以同样的速率泵出细胞悬浮液，在维持细胞培养生物反应器稳定的同时又要保证细胞能够在反应器中的停留时间内扩增至0.2～1.0×107cells/mL(对于微载体悬浮培养时，微载体上80～90％汇满细胞)，维持反应器中的高细胞密度状态，实现细胞的连续培养。以30～90rpm的搅拌转速进行物质混合，特别是微载体悬浮连续培养细胞时，为利于细胞在微载体间通过“珠转珠”方式的转移，转速不能太快。本专利技术由于涉及到细胞培养的最佳条件和病毒增殖最佳条件的关联，为提高整个反应系统的操作弹性，病毒增殖反应器的体积是细胞培养生物反应器体积的2～5倍，同时将病毒增殖分为初级感染增殖和连续增殖两个阶段，分别采取微分式初期增殖方式和带有细胞、载体回流装置的连续增殖方式进行。所述的步骤3)中，初级感染增殖，具体是指所增殖的病毒包括可以在相应宿主细胞中增殖并分泌到细胞外病毒，如狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、出血热病毒、猪流行性腹泻病毒、乙脑病毒、轮状病毒等。病毒增殖培养过程中的pH、温度、溶解氧等培养条件可以根据不同的病毒而选择适当的、该领域技术人员所熟知的培养条件，比如，在pH7.0～7.2，32℃～34℃下用Vero细胞培养流感病毒；在pH7.8、35℃下用Vero细胞生产狂犬病毒，溶解氧控制25％～60％。若细胞培养阶段选用的是含有4％～10％血清的DMEM、Eagle MEM、RPMI1640、Medium本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种安全连续封闭式细胞培养、病毒生产／灭活的方法，其特征在于，包含以下步骤：１）向细胞培养生物反应器中接种１～２×１０↑［５］ｃｅｌｌｓ／ｍＬ的细胞，悬浮培养，扩增至０．２～１．０×１０↑［７］ｃｅｌｌｓ／ｍＬ，对于微载体悬浮培养时 ，微载体上８０～９０％汇满细胞，实现细胞的初级培养；２）根据培养细胞的生长特性和生物反应器体积的大小，以０．３～１．０倍反应器工作体积／天的流速流加新鲜培养基，同时以同样流速泵出细胞悬浮液，维持细胞培养生物反应器稳定的同时，保证细胞 在反应器中的停留时间内扩增至０．２～１．０×１０↑［７］ｃｅｌｌｓ／ｍＬ，对于微载体悬浮培养时，微载体上８０～９０％汇满细胞，实现细胞的连续培养；３）泵出细胞悬浮液至含有感染复数为２～１０病毒的病毒增殖反应器，实现病毒在细胞中的初级 感染增殖；４）随着细胞悬浮液的不断流入和病毒上清液的不断流出，在维持整个系统动态平衡的过程中实现病毒的连续增殖；５）用病毒收集罐收集从病毒增殖反应器中泵出的病毒上清液，灭活病毒，实现连续封闭培养细胞和灭活病毒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：罗凤山，齐瀚实，陈彦田，孙海英，耿涛，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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