本发明专利技术属于医学分子生物学领域，具体涉及一种表达人外源胰岛素原的人造血干细胞及其制备方法和应用。本发明专利技术的表达人外源胰岛素原的人造血干细胞是采用DNA重组技术，将人胰岛素原基因克隆至慢病毒表达载体中，获得能够表达人胰岛素原基因的慢病毒表达载体，将该表达载体和慢病毒包装质粒共同转染至293FT细胞，包装慢病毒颗粒，收集含病毒的细胞培养液上清，感染新分离的UCB HSCs，获得表达人外源胰岛素原的人造血干细胞，该人造血干细胞在体外能够扩增，扩增细胞经细胞移植，在体内能够进行正常的自我更新和多向分化，分泌的proinsulin能够激活insulin受体及其下游靶基因，移植到NOD/SCID/Diabetes I小鼠能够显著减低I型糖尿病小鼠的血糖，提高小鼠存活率。
【技术实现步骤摘要】
表达人外源胰岛素原的人造血干细胞及其应用
本专利技术属于医学分子生物学领域，具体涉及一种表达人外源胰岛素原的人造血干 细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
糖尿病是严重危害人类健康的主要疾病之一，已经成为继心血管疾病和肿瘤之后 的第三大疾病。近年来，糖尿病的发病率不断上升，而且发病更趋年轻化。 糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或 其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病病人由于产生胰岛素障碍或胰岛素不能发挥生 理作用引起糖代谢紊乱导致微血管病变，引起肢体坏死、失明和肾功能衰竭等一系列严重 的并发症。目前尚无根治糖尿病的方法，但通过多种治疗手段可以控制好糖尿病，胰岛素治 疗是其中一种有效的方法。虽然采用胰岛素治疗在一定程度上能够改善病人的糖代谢紊 舌L然而长期的胰岛素注射不仅在治疗上给病人带来不便，并且这种方法并不能有效地防 止或逆转糖尿病引起的微血管病变及其并发症。 细胞移植是将在体外建立的功能性细胞移植到体内替代功能缺陷的细胞，以达到 治疗疾病的目的。近年来，许多研究者致力于利用现代基因工程技术改造或新建各种可分 泌胰岛素的细胞系，主要有胰岛细胞系、胰岛干细胞系和非胰岛细胞系。 相当数量的生物因子在胰岛β细胞产生、发育、分裂这一过程当中起着调节的作 用。所有基因的启动与关闭，所有蛋白质的激活和失活，都是由一个复杂的过程来调控的。 基于这个观点，研究人员把胰岛β细胞产生、发育、分裂这一过程所必须的生物因子转入 体内，用来促使胰岛β细胞成熟。 研究人员于本世纪初，初次选用胰岛发育因子神经元素胰腺十二指肠同源异型盒 基因 I (pancreatic duodenal homeobox-l，PDX_l)等促使非内分泌细胞转变为膜岛细胞 或者β细胞显型来取代胰岛移植进行1型糖尿病治疗的研究。PDX-I蛋白可以参与调控 insulin基因的转录。PDX-I蛋白还可以促进胰腺的发育、维持胰岛β细胞特异基因的表 达。胰腺中的全部细胞在器官形成时均有I 3DX-I基因的表达，而在成体后，PDX-I基因则局 限表达于胰岛β细胞。利用rox-ι对非β细胞进行直接或间接修饰将会成为糖尿病基因 治疗中一个极具潜力的发展方向。Raikwar等将rox-l基因转入小鼠的胚胎干细胞使其大 部分分化为胰岛素产生细胞。Talebi等将以慢病毒为载体的Η)Χ-1基因导入骨髓间充质干 细胞，同时标记表达神经素3和GLUT2,并且确定之一系列因子的表达并不会对insulin基 因的表达产生影响。在对此细胞蛋白质的免疫分析中发现，PDX-I基因和insulin基因均 有表达。将这种roxr的骨髓间充质干细胞注入1型糖尿病大鼠后，大鼠血糖水平在三天 内从485mg/L下降到正常水平。该研究数据显示，PDX-I+的骨髓间充质干细胞具有基因治 疗1型糖尿病的潜能。 多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells)是当前干细胞研 究的热点。iPS细胞在修复与重建受损器官，治愈疾病等方面都拥有潜在的研究价值。许多 研究人员认为，iPS将会被大范围应用于糖尿病的胰岛细胞移植和各类受损、缺陷器官的自 体移植等领域。Deng等成功地用表皮生长因子等诱导人多潜能干细胞分化为胰岛素分泌 型细胞，其中可以正常分泌胰岛素的细胞超约有25%，这一研究成果在用人iPS治疗糖尿 病的领域获得了非常大的突破。Zhou等将携带有roXl、Ngn3和Mafa等三个与胰腺发育有 关的转录因子的腺病毒载体注入缺少胰岛β细胞的小鼠胰腺，选择性的转染胰腺外分泌 细胞。结果显示，超过两成的外分泌型细胞转化为了胰岛β细胞。虽然有研究表明iPS移 植可能产生免疫排斥，但是，最近的两个实验则证实了将同基因的iPS细胞所分化的细胞 进行移植并不会产生免疫反应或排斥，而先前的研究结果可能是使用了逆转录病毒感染的 iPS细胞导致的。 申请号为200710100326. 1的专利技术专利公开了一种应用编码多种外源基因的慢病 毒载体制备分泌胰岛素的干细胞系的方法，该方法是将多种胰岛素调控基因克隆至复制缺 陷型慢病毒载体PWPST，转染293T细胞进行包装后，收集病毒颗粒并浓缩后转染人胚胎胰 腺干细胞，这种含有多种胰岛素调控基因的慢病毒载体在转染干细胞后，可以使干细胞合 成胰岛素的能力大幅度提高，并在葡萄糖的刺激时产生明显的胰岛素释放，该专利中仅仅 介绍了体外培养可以提高胰岛素的分泌，但将细胞系移植入动物模型体内效果如何不得而 知。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种重组慢病毒表达载体，其携带有人胰 岛素原基因（preproinsulin);本专利技术的目的之二在于提供一种重组慢病毒颗粒，其是由 所述的重组慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒共同转染宿主细胞后包装得到；本专利技术的目 的之三在于提供一种表达人外源胰岛素原的人造血干细胞，这种表达人外源胰岛素原的人 造血干细胞能够分泌有生物活性的人胰岛素原并且保持造血干细胞自我更新和多向分化 的特性；本专利技术的目的之四在于提供一种表达人外源胰岛素原的人造血干细胞的体外扩增 方法，在单独使用CHIR99021或者LiCl，不需要其他细胞因子的条件下，表达人外源胰岛素 原的人造血干细胞能够有效扩增，扩增细胞保持造血干细胞的特性。 为实现上述目的，本专利技术的技术方案为： -种重组慢病毒表达载体，所述重组慢病毒表达载体是在慢病毒载体 pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-T2A-Puro的多克隆位点插入序列如SEQ ID NO :1所示的人胰岛素 原的基因序列，获得含有人胰岛素原基因的重组慢病毒表达载体；所述人胰岛素原的基因 序列插入慢病毒载体EcoRl和BamHl位点之间。 胰岛素本身并不是胰岛素基因控制合成的直接产物，其直接产物是前胰岛素原 (pr印roinsulin)。它由NH2-末端信号序列（称为信号肽），B链、C肽（又叫连接肽， connecting piptide)和具COOH-末端的A链等部分组成的单链由N端至C端的连接顺序 为S-B-ARG-Arg-C-Lys-Arg-A，其中S为信号肽，C代表C-肽，由35个氨基酸残基组成，A 和B分别为胰岛素的A链和B链。全长119个氨基酸残基。信号肽由24个氨基酸残基组 成，富含疏水氨基酸。在信号肽的作用下，正在合成的肽链进入内质网腔，经过信号肽酶的 切割作用，移去信号肽，形成胰岛素原。胰岛素原分子发生折叠，使其2个末断片段A和B 之间形成正确的二硫键，并最终包装成分泌颗粒的形式储藏在高尔基体中。当机体需要时， 高尔基体中的转换酶（convertase)PC3和PC2-一类与枯草蛋白酶相关的内切蛋白酶一便 会分别对胰岛素原分子中的B/C和C/A连接点发生切割作用，再在羧肽酶的作用下的分别 切去Arg-Arg和Arg-Lys碱性二肽，从而移走了一段长度为31个氨基酸的C肽，成为成熟 的胰岛素。 一种重组慢病毒颗粒，将上述得到的重组慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒共同 转染宿主细胞后得到的包装体即为重组慢病毒颗粒。慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整 合本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组慢病毒表达载体，其特征在于：所述重组慢病毒表达载体是在慢病毒载体pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑GFP‑T2A‑Puro的多克隆位点插入序列如SEQ ID NO：1所示的人胰岛素原的基因序列，获得含有人胰岛素原基因的重组慢病毒表达载体；所述人胰岛素原的基因序列插入慢病毒载体EcoR1和BamH1位点之间。
【技术特征摘要】
1. 一种重组慢病毒表达载体，其特征在于：所述重组慢病毒表达载体是在慢病毒载体 pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-T2A-Puro的多克隆位点插入序列如SEQ ID NO :1所示的人胰岛素 原的基因序列，获得含有人胰岛素原基因的重组慢病毒表达载体；所述人胰岛素原的基因 序列插入慢病毒载体EcoRl和BamHl位点之间。2. -种重组慢病毒颗粒，其特征在于：将权利要求1所述的重组慢病毒表达载体和慢 病毒包装质粒共同转染宿主细胞后得到的包装体即为重组慢病毒颗粒。3. 根据权利要求2所述的一种重组慢病毒颗粒，其特征在于，所述宿主细胞为293FT。4. 一种表达人外源胰岛素原的人造血干细胞，其特征在于，所述表达人外源胰岛素原 的人造血干细胞是转染有权利要求2或3所述的重组慢病毒颗粒的人造血干细胞，所述的 人造血干细胞为人脐带血造血干细胞。5. 权利要求4所述的表达人外源胰岛素原的人造血干细胞的体外扩增方法，其特征在 于，在单独使用CHIR99021或者LiCl，不需要其他细胞因子的条件下，培养7天，UCB HSCs/ proinsulin数量扩增10倍，扩增细胞保持原始细胞的生物学特性；所述CHIR99021浓度为 3uM-5uM，所述 LiCl 浓...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶治家，韩月雯，汤玲，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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