一种利用DNA损伤修复机制使单克隆抗体细胞株进行体内快速进化的新方法技术

本发明专利技术提供了一种利用DNA损伤修复机制使单克隆抗体细胞株进行体内抗体快速进化的新方法，该方法分为两个部分：过表达AID突变体及提高AID在抗体基因位点的募集以提高抗体CDR区域的突变率。过表达AID突变体即是采用在单克隆细胞株中过表达AID突变体以提高抗体CDR区域的突变率，使其达到10-3/代。另外提高AID在CDR位点的募集是依靠某些染色质重塑因子(如SIRT2和DDB1)引发染色质构象的变化，由于AID向CDR区域的招募依赖于染色质构象的变化，某些特定变化可以提高AID在CDR位点的募集，因此可进一步提高抗体可变区的突变率，达到10-2/代，可以用于高亲和力快速筛选工艺。

【技术实现步骤摘要】
一种利用DNA损伤修复机制使单克隆抗体细胞株进行体内快速进化的新方法
本专利技术属于生物
，具体为一种利用DNA损伤修复机制对单克隆细胞株进行体内快速进化的新方法。
技术介绍
单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)，简称单抗，是仅由可以制造这种抗体的免疫细胞与癌细胞融合后的杂交瘤细胞产生的。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致。单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类疾病的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。单克隆抗体较多克隆抗体具有如下几个优点。1.杂交瘤实现体外永生化并持续传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。2.由于可能得到“无限量”的均一性抗体，使得抗体作为药物成为可能。3.可以实现标准化生产，用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法。4.由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于治疗性药物、放射免疫显像、医学诊断试剂甚至环境污染的检测等广泛领域。单克隆抗体的制备虽然在细节上有各种优化，但是技术框架已经相对成熟。人源化/全人源单克隆抗体的设计与开发的技术流程包括靶点选择与验证、针对靶点单抗制备、抗体筛选、抗体基因克隆、抗体人源化、抗体亲和成熟、人抗体制备、动物模型研究和临床试验等。目前，抗体药物研发很多方面还存在较大的发展空间。其中，抗体亲和力和特异性等特性的提升是抗体研发最为关键，也是最容易遭遇技术瓶颈的的步骤。抗体库容量的产生机制主要包括组合多样性、连接多样性和体细胞高频突变，而高亲和力抗体是在体细胞高频突变和抗原选择下产生的。B细胞在识别抗原后发生分裂增殖的过程中产生体细胞高频突变，且突变主要集中在重、轻链可变区内决定抗体与抗原亲和力的互补决定区(CDR)。因此，体细胞高频突变能产生高亲和力的抗体，而具有高亲和力抗体的B细胞在低浓度抗原刺激下会优先活化增殖，逐渐形成高亲和力的B细胞优势细胞群，进一步分泌产生高亲和力抗体。抗体库技术是利用分子克隆技术扩增全套抗体重、轻链可变区基因，然后与特定的表达载体连接，转化到宿主细胞中表达出有功能的抗体，并通过亲和筛选等方法筛选到高亲和力的特异性抗体。抗体库技术经历体内和体外发展阶段，其中体内以噬菌体抗体库技术最为常见，体外以核糖体和mRNA抗体库技术最为常见。抗体库方法和技术通过模拟抗体在机体内生成的重要环节，如多样性B细胞群体、克隆选择、亲和力成熟等，加快了抗体制备的速度，降低了生产成本，为快速从大库容量的抗体库中筛选并大规模制备高亲和力特异性抗体提供了简便而高效的操作系统。但是抗体库方法和技术目前仍然存在亟待解决的问题，例如在保证抗体库多样性和呈现效率的同时，如何提高库容量以及抗体产量等问题。而且抗体的轻链可变区对于抗体的稳定性，亲和力非常重要，这就造成现有体外抗体演化技术不可逾越的瓶颈。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术公开了一种我们研发了基于单克隆抗体细胞株的体内抗体进化技术。该方法利用AID突变体及控制其在CDR区的招募情况可以使可变区的突变几率达到10-3-10-2/代，可以用于高亲和力抗体快速筛选工艺。为达到上述目的，本专利技术的实施采用如下方案。首先在NCBI上查询确定小鼠AID、DDB1和SIRT2基因的标准序列，再根据核酸序列设计相应的扩增引物。将这三个基因通过同源重组的方法克隆至慢病毒骨架载体。AID基因的38位氨基酸通过定点突变方法转换为甘氨酸(AIDmutant)。进一步的根据三质粒慢病毒系统方法，包装获得病毒上清，再进行转染获得分别转染进Plv-AID、Plv-DDB1和Plv-SIRT2单质粒，Plv-DDB1和Plv-SIRT2双质粒及三质粒共转的五个稳定的细胞系。进一步的通过使用OMEGA公司的RNA提取试剂盒提取Plv-AIDmutant、Plv-DDB1和Plv-SIRT2单质粒及三质粒共转的细胞系中RNA进行反转获得CDNA。在进一步用PCR的方法检查Plv-AIDmutant、Plv-DDB1和Plv-SIRT2单质粒及三质粒共转的细胞系中抗体突变率的变化情况。确定三质粒共转的细胞系中抗体突变进化率最高。进一步的通过染色体共沉淀(ChIP)实验，验证DDB1，SIRT2蛋白可以直接影响AID在抗体基因VDJ上的募集，因此诱发胞内抗体突变率的进一步提升(图4,5中显示可达到10-2/代)。本专利技术中利用AID基因的突变体及DDB1、SIRT2蛋白对染色质构象的影响，在基因组DNA序列水平上实现了胞内抗体进化的加速，是一种创新性的专利技术。对治疗性抗体的研发及规模化生产意义重大。具体实施方式将AID基因克隆用同源重组法到慢病毒载体(PLV-GFP)。酶切鉴定Plv-AID质粒(如图1中所示)酶切片段大小为600左右，与预期相符。同上，将DDB1和SIRT2基因克隆到慢病毒载体PLV-GFP。酶切鉴定Plv-DDB1和Plv-SIRT2质粒(如图1中所示)酶切片段大小分别为3500及1100左右，与预期相符。将Plv-AIDmutant、Plv-DDB1和Plv-SIRT2质粒与三质粒慢病毒系统中的包装质粒PMD2G和PsPAX2用磷酸钙法共转染293T细胞，72小时后包装成相应慢病毒，包装细胞呈现强烈荧光(如图2中所示)(GFP荧光图片)。将以上三种慢病毒感染单克隆细胞株VEGFR-E3，一周后进行以下实验：使用OMEGA公司生产的E.Z.N.ATMTotalRNAKitⅡ(R6934-02)提取Plv-AIDmutant、Plv-DDB1和Plv-SIRT2单质粒及三质粒共转的细胞系细胞中RNA，反转后获得cDNA,以通用引物GCTAGTGAGCTCTTTGCCCAG及AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA对V1、V2、V3区进行多聚酶链反应扩增(PCR)并测序；结果显示，过表达这三种基因的情况下，抗体CDR区序列突变率提高3-12倍；三种基因共同过表达条件下，突变率更提高为102倍(如图3中所示)。用AID抗体进行染色质免疫共沉淀，测定AID蛋白在Plv-DDB1和Plv-SIRT2感染的VEGFR-E3单克隆细胞株中向CDR(CDR3)染色质区域招募的能力。结果显示过表达DDB1和SIRT2的情况下，AID向抗体基因CDR(CDR3)区域招募的能力提高约3倍(如图4中所示)。附图说明：图1是慢病毒载体Plv-AIDmutant、Plv-DDB1和Plv-SIRT2酶切鉴定图。图2是Plv-AIDmutant、Plv-DDB1和Plv-SIRT2质粒转染包装细胞后表达绿色荧光蛋白图。图3是杂交瘤单克隆细胞株(VEGFR-E3)感染DDB1、SIRT2及AIDmutant慢病毒后胞内抗体CDR位点突变率增高图。图4是ChIP实验验证DDB1及SIRT2蛋白可以提高AID在抗体基因CDR区的富集图。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用DNA损伤修复机制使单克隆抗体细胞株进行体内抗体快速进化的新方法，其特征在于：过表达AID突变体及提高AID在VDJ位点的募集可以提高抗体VDJ区域的突变率，达到10‑3‑10‑2/代，可以用于高亲和力抗体快速筛选工艺。

【技术特征摘要】
1.一种利用DNA损伤修复机制使单克隆抗体细胞株进行体内抗体快速进化的方法，其特征在于：过表达AID突变体及提高AI...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘聪，章崇杰，
申请(专利权)人：成都中联生科基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51