一种内切β－１，３葡聚糖酶基因及其克隆方法，属于微生物基因工程领域。本发明专利技术提供了来源于粗糙脉孢菌（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）ＡＳ ３．１６０４的一种内切β－１，３葡聚糖酶基因ｇｌｕ，提供了基因ｇｌｕ的核苷酸序列和相应蛋白质的氨基酸序列，提供了含有基因ｇｌｕ的大肠杆菌表达载体ｐＥＴ２８ａ－ｇｌｕ以及在大肠杆菌中的高效表达。本发明专利技术可用于内切β－１，３葡聚糖酶工业化生产的基因工程菌的构建，提高微生物发酵法生产内切β－１，３葡聚糖酶的水平和质量。
【技术实现步骤摘要】
,3葡聚糖酶基因及其克隆方法
一种内切β-1，3葡聚糖酶基因及其克隆方法，属于微生物基因工程领域。
技术介绍
β-1，3-葡聚糖酶分为内切β-1，3-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)和外切β-1，3-葡聚糖酶(EC3.2.1.58)，广泛分布在细菌，真菌和高等植物中。内切β-1，3-葡聚糖酶以内部随机切割方式专一性水解以β-1，3-糖苷键聚合的高分子葡聚糖，产物为寡糖或葡萄糖。β-1，3-葡聚糖酶的生理功能因来源而异在植物中，尽管有研究显示它在细胞分化中起一定作用，但它主要是作为一种病原真菌的防御系统；在细菌中，它起营养作用，因为大部分细菌不含有β-1，3-葡聚糖；在真菌中，β-1，3-葡聚糖酶有许多不同的功能，首先，有研究表明它在真菌发育和分化期间形态的形成与瓦解过程中具有一定生理作用；其次，作为裂解酶类，β-1，3-葡聚糖酶与碳源和能源枯竭时β-1，3-葡聚糖的转移有关系。β-1，3-糖苷键存在于禾本科植物(玉米、水稻、高粱等)细胞壁半纤维素的非淀粉多糖中，并且一般是在支链上，是导致溶液黏度上升的重要原因之一。内切β-1，3-葡聚糖酶的添加可以使β-1，3-糖苷键支链所形成的网状结构解体，增加多糖的水溶性，进而被有效利用。例如，在饮料工业中，葡聚糖是导致啤酒和果汁浑浊的因素之一，尤其在麦汁过滤过程中葡聚糖的存在严重的阻碍着过滤，大大减慢过滤速度。高活性又稳定的葡聚糖酶的添加无疑大大便于过虑和澄清。另外，在饲料工业中，一方面，β-葡聚糖溶解后使食糜的粘度增大，不利于其他营养成分的消化和吸收；另一方面，未被消化和吸收的葡聚糖具有强烈的吸水性，大大增加了动物的排便量，对环境是极不友好的。内切β-1，3-葡聚糖酶的添加既可以降低饲料的粘度，增加畜禽和鱼类的采食量，又可以减少其排便体积，从而减轻对环境的污染。可见，内切β-1，3-葡聚糖酶开发和研究具有重要意义。国内外学者在内切β-1，3-葡聚糖酶的异源表达方面进行的研究工作不多。Vladimir V.Zverlov等从热孢菌(Thermotoga neapolitana)中克隆并在大肠杆菌中成功表达了一种嗜热β-1，3-葡聚糖酶(LminA)。Hong等从链霉菌 (Streptomyces sioyaensis)中成功克隆并在大肠杆菌中表达了内切β-1，3-葡聚糖酶。蓝海燕等对烟草来源的β-1，3-葡聚糖酶进行了cDNA克隆，并成功在大肠杆菌中表达。
技术实现思路
本专利技术的目的是寻找一种新的β-1，3-葡聚糖酶及其编码基因，再利用基因扩增等手段克隆了该酶基因，最后在大肠杆菌中表达和制备该β-1，3-葡聚糖酶。本专利技术提供了一种来源于粗糙脉孢菌中的β-1，3-葡聚糖酶基因序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有粗糙脉孢菌的β-1，3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中表达的表达载体pET28a-glu及其基因重组菌EC-Glu。利用本专利技术成果，可以用于β-1，3-葡聚糖酶工业化生产的基因工程菌的构建及其规模化制备。本专利技术的技术方案用BLAST软件，以内切β-1，3-葡聚糖酶的氨基酸序列搜索微生物基因组序列，粗糙脉胞菌基因组序列中的开放阅读框架B23B10.170编码产物可能是内切β-1，3-葡聚糖酶。从基因组序列中提取这段序列，采用GenScan软件分析发现此基因含有两个内含子，用SignalP V2.0程序分析这段基因的编码产物。确定其为分泌性蛋白并确定了信号肽的切割位点。在上述分析的基础上，设计引物P1，P2，以粗糙脉胞菌AS 3.1604的染色体DNA为模板，PCR扩增出2432bp不含编码信号肽序列的核苷酸片段gluA，PCR扩增条件为95℃5min；94℃30s，54℃50s，72℃2min 30s，35个循环；72℃10min；扩增得到目的片段gluA经EcoRI酶切与相同酶切的pUC18连接，获得重组质粒pUC-gluA。核苷酸序列测定确认获得内切β-1，3葡聚糖酶基因gluA，其中在第267碱基之后的61bp为第一个内含子，在第448碱基之后的34bp为第二个内含子。采用PCR方法进行外显子拼接，去除目的基因中的两个内含子。首先设计引物P3、P4、P5和P6，其中P3和P4，P5和P6两对引物5’端分别有20个和23个碱基是互补的，以便于拼接。以pUC-gluA为模板，P1和P3，P4和P2为引物作PCR，分别扩增获得PCR产物P1P3和P4P2。获得产物P1P3的PCR扩增条件是95℃5min；94℃30s，54℃50s，72℃30s，35个循环；72℃10min；获得PCR产物P4P2的PCR扩增条件是95℃5min；94℃30s，54℃50s，72℃2min，35个循环；72℃10min。然后以P1P3和P4P2的混合物为模板，通过引物P1和P2进行PCR拼接，去除第一个内含子intr1。以所得去除第一个内含子后的产物为模板，再用P1，P2，P5和P6组合，重复上述过程相同条件进行PCR扩增，先获得产物P1P5和P6P2，再通过引物P1，P2进行PCR拼接，去除第二个内含子intr2，将去除内含子的glu克隆入pUC18，获得重组质粒pUC-glu并进行序列测定，确认内含子已正确去除。基因glu的核苷酸序列如下atgtctccat tgctggacgt ctccgcttca gtctccttga actggaccag cgctcaaggt 60gtttccgacc gaccgaccag gttttggtac tccagtatcg accacagcac tccccttgtg 120cgcggcttcg ctcccgacct tgacggagat gtcaactatg ccgtcttcaa ggcagtgaaa 180cccggcgatg gggcgagtat ccaaacagcg atcaactcgg ggaccaacgg tgctaagaga 240cacggtctat ggtttgcttc ccagccacga gttgtgtaca taccgccggg aacatacgag 300atctctgaga ccatcttcat gaacactgac acagttctga tgggcgacgc aacagatgta 360aggacgatgg cctctcccat gcaagcggaa ccacccatca tcaaagcatc ttcgaacttc 420tccgggaatc aaacgttgat ctctggccaa gaccccgcaa ctggtatttc cggtgagcta 480tcgttcgccg tctccttgaa gaacttaatc ctcgacacca ccaatatccc aggagaccaa 540gccttcacag ctctctggtg gggtgttgct caaggagctc agttgcagaa tgtgaagatc 600cgtatggcgc ctgccatcga tggtgaggga cacagtggta ttcgcctcgg ccgtggctcg 660actctcggag tttcggatgt tcgtatcgaa tacgggcaaa acggtatctg gtataa本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来源于粗糙脉孢菌（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）ＡＳ３．１６０４中的内切β－１，３葡聚糖酶基因ｇｌｕ，其核苷酸序列为：ａｔｇｔｃｔｃｃａｔｔｇｃｔｇｇａｃｇｔｃｔｃｃｇｃｔｔｃａｇｔｃｔｃｃｔｔｇａａ ｃｔｇｇａｃｃａｇｃｇｃｔｃａａｇｇｔ６０ｇｔｔｔｃｃｇａｃｃｇａｃｃｇａｃｃａｇｇｔｔｔｔｇｇｔａｃｔｃｃａｇｔａｔｃｇａｃｃａｃａｇｃａｃｔｃｃｃｃｔｔｇｔｇ１２０ｃｇｃｇｇｃｔｔｃｇ ｃｔｃｃｃｇａｃｃｔｔｇａｃｇｇａｇａｔｇｔｃａａｃｔａｔｇｃｃｇｔｃｔｔｃａａｇｇｃａｇｔｇａａａ１８０ｃｃｃｇｇｃｇａｔｇｇｇｇｃｇａｇｔａｔｃｃａａａｃａｇｃｇａｔｃａａｃｔｃｇｇｇｇａｃｃ ａａｃｇｇｔｇｃｔａａｇａｇａ２４０ｃａｃｇｇｔｃｔａｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔｃｃｃａｇｃｃａｃｇａｇｔｔｇｔｇｔａｃａｔａｃｃｇｃｃｇｇｇａａｃａｔａｃｇａｇ３００ａｔｃｔｃｔｇａｇａｃｃａ ｔｃｔｔｃａｔｇａａｃａｃｔｇａｃａｃａｇｔｔｃｔｇａｔｇｇｇｃｇａｃｇｃａａｃａｇａｔｇｔａ３６０ａｇｇａｃｇａｔｇｇｃｃｔｃｔｃｃｃａｔｇｃａａｇｃｇｇａａｃｃａｃｃｃａｔｃａｔｃａａａｇｃａ ｔｃ ｔｔｃｇａａｃｔｔｃ４２０ｔｃｃｇｇｇａａｔｃａａａｃｇｔｔｇａｔｃｔｃｔｇｇｃｃａａｇａｃｃｃｃｇｃａａｃｔｇｇｔａｔｔｔｃｃｇｇｔｇａｇｃｔａ４８０ｔｃｇｔｔｃｇｃｃｇｔｃｔｃｃ ｔｔｇａａｇａａｃｔｔａａｔｃｃｔｃｇａｃａｃｃａｃｃａａｔａｔｃｃｃａｇｇａｇａｃｃａａ５４０ｇｃｃｔｔｃａｃａｇｃｔｃｔｃｔｇｇｔｇｇｇｇｔｇｔｔｇｃｔｃａａｇｇａｇｃｔｃａｇｔｔｇｃａｇａａ ｔｇｔｇａａｇａｔｃ６００ｃｇｔａｔｇｇｃｇｃｃｔｇｃｃａｔｃｇａｔｇｇｔｇａｇｇｇａｃａｃａｇｔｇｇｔａｔｔｃｇｃｃｔｃｇｇｃｃｇｔｇｇｃｔｃｇ６６０ａｃｔｃｔｃｇｇａｇｔｔｔｃｇｇａｔ ｇｔｔｃｇｔａｔｃｇａａｔａｃｇｇｇｃａａａａｃｇｇｔａｔｃｔｇｇｔａｔａａｃｇｇｃ７２０ｃａｔｃａｇｃａａｇｃａｇｔｔｔｔｃ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王正祥，马骏双，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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