一种新的内切葡聚糖酶制造技术

一种酶制剂，其中包含在温度８５℃以上时具有最佳酶活性的一种内切－１，４－β－葡聚糖酶，它是属于革兰氏阳性细菌门的菌株（例如网球菌ＤＳＭ６２６２菌株）的内源酶，或者在７０℃，ｐＨ１０时该酶显示的对羧甲基纤维素（ＣＭＣ测定）的相对活性是在７０℃，最适ｐＨ时的５０％以上；一种ＤＮＡ构建体，它含有编码内切－１，４－β－葡聚糖酶的一段ＤＮＡ序列；该酶可以应用于例如纺织工业中，以提高纤维素纤维或织物的品质，或使其具有粗斜纹棉布的石洗外观；或者用于工业清洁程序；或者用于热压聚合物材料；或者用于将生物量转化成糖；或者用于生产乙醇；或者用于预消化例如饲料生产中所用的谷物；或者用于生产速溶咖啡或相似的提取过程。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种在高温时有纤维素分解活性的酶，特别是内切葡聚糖酶；编码有纤维素分解活性的酶的克隆DNA序列；提供编码这种酶的基因的方法；生产这种酶的方法；一种含有具纤维素分解活性的酶的酶组合物；以及该酶和酶组合物的多种工业应用。
技术介绍
纤维素酶或纤维素分解酶是参与纤维素分解过程的酶。天然纤维素的水解中，众所周知有三类主要的纤维素酶参与这一过程，即纤维素二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纤维素二糖水解酶，EC3.2.1.91)，内切-β-1，4-葡聚糖酶(内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21).特别是内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)构成一组用于上述工业用途的引人注意的水解酶。内切葡聚糖酶催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中1，4-β-D-葡糖苷键的内切水解，及混合β-1，3-葡聚糖，如谷类β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖(xyloglucan)和含有纤维素部分的其他植物原料的β-1，4键的内切水解。其权威命名是内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，本说明书使用简称内切葡聚糖酶。可以参考T.M.Enveri，“微生物纤维素酶”，W.M.Fogarty，微生物酶类与生物技术，应用科学出版社，183-224页(1983)；酶学方法(1988)160卷，200-391页(Wood，W.A和Kellogg，S.T.编)；Beguin，P.“纤维素降解的分子生物学”，微生物学年度综述(1990)，44卷，219-248页；Beguin，P.和Aubert，J-P.“纤维素的生物降解”，FEMS微生物学综述13(1994)25-58页；Henrissat，B.“纤维素酶及它们与纤维素的相互作用”，纤维素(1994)，1卷，169-196页。纤维素酶在大量微生物中都能合成，包括真菌，放线菌，粘细菌和真细菌，也能由植物合成。特别是已鉴定到具有各种特性的内切葡聚糖酶。许多细菌内切葡聚糖酶已被描述(Henrissat，B.和Bairoch，A.(1993)生物化学杂志293781-788；Gilbert，H.J.和Hazlewood，G.P.(1993)普通微生物学杂志139187-194)。梭菌亚门是一组多样化的厌氧细菌，包含生理学上非常不同的各属。以前，梭菌属被认为是包括所有内生芽孢厌氧细菌的一个属。但分子分类学手段例如16S rDNA测序的应用揭示这组微生物的不同远超过了属以上分类位置。而且，多个不产芽孢的厌氧菌属被分类到梭菌中，因此梭菌是作为一个更上位的分类组，即一个亚门。这与这些生物的高度不同的生活环境一致。梭菌亚门，例如，包含最适生长温度范围极宽的多个种类。网球菌属包含系统发生上位于梭菌亚门内的极端嗜热厌氧细菌。网球菌是梭菌亚门中最嗜热的微生物之一。在16S rDNA系统发生树中，网球菌属与其他嗜热菌属例如热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)和共养单胞菌属有最近的亲源关系。但是网球菌属形成了一个远的分支，证明网球菌应该被看作一个独立的属。网球菌B1菌株分离自一个浆质冷却池(即一个人造嗜热环境)的污泥和纸浆样品中。关于该微生物的木聚糖酶的最适温度(大约90℃)已有描述。已针对该木聚糖酶的产量进行了研究，以使发酵最优化。网球菌属的菌种产生内切葡聚糖酶未有报导。梭菌门中已有描述产纤维素酶的一些种中有几个是嗜热的。少数例子中测定过内切葡聚糖酶的热稳定性，研究最多的种之一是热纤维梭菌，已证明它的酶在80℃仍稳定。解纤维热厌氧杆菌(Thermoanaerobactercellulyticus)产生至少两种80℃稳定的内切葡聚糖酶。可以参考Hudson等(1991)一株极端嗜热菌的纤维素酶活性，应用微生物学与生物技术35270-273；Mathrani和Ahring(1991)来自来自人工嗜热环境的严格降解木聚糖的网球菌的分离和鉴定，微生物学文献15713-17；Adamsen等(1995)，连续培养网球菌B1生产胞外木聚糖酶的优化，应用微生物学与生物技术44327-332；Maidak等(1994)，核糖体数据库计划，核酸研究223485-3487；Honda等(1987)编码耐热β-葡聚糖酶的解纤维热厌氧杆菌基因在E.coli中的克隆和表达，应用微生物学与生物技术25480-483；Honda等(1988)，从一株嗜热厌氧菌分离一种新纤维素酶基因及其在E.coli中的表达，应用微生物学与生物技术29264-268。纤维素分解酶一个重要的工业用途是处理纤维素纺织品或织物，例如作为洗涤剂组合物或织物柔软剂组合物的成分，用于新织物的生物抛光(衣物整理)，及获得含纤维素织物(特别是粗斜纹棉布)的“石洗”外观，这些处理过程的某些方法已被提及，例如，在GB-A-1 368 599，EP-A-0 307 564和EP-A-0 435 876，WO91/17243，WO91/10732，WO91/17244，PCT/DK95/000108和PCT/DK95/00132中。纤维素分解酶另一个重要的工业用途是用于处理纸浆，如用于改善排水或回收纸张的除墨。人们还知道，纤维素酶可以含有或不含有纤维素结合结构域(CBD)。CBD能够增强酶与含纤维素的纤维的结合，并提高酶催化活性部位的功效。需要提供经济可行的纤维素酶制剂，可以用在那些希望纤维素酶(优选是内切葡聚糖酶)在高温保持活性的应用。本专利技术的目的是提供新的酶组合物或重组酶，它们在高温条件下具有显著的纤维素分解酶活性，并且在工业应用中，如纸浆加工，纺织品处理，洗衣过程，提取过程或动物饲养中，其性能有所改进。专利技术概述本专利技术人已经成功克隆和鉴定了一种来自网球菌属的DNA序列，它编码的酶在极高温度下，很宽的pH范围内具有纤维素分解活性，从而有可能用它制备具有所期望特性的单组分纤维素分解酶组合物。因此，本专利技术第一方面涉及具有内切葡聚糖酶活性的酶制剂，它在85℃以上，优选90℃以上，更优选95℃以上，特别是100℃以上具有最佳活性。本专利技术第二方面涉及一种酶制剂，相对于在70℃和最适pH时的活性，它对羧甲基纤维素(CMC)的内切葡聚糖酶活性在70℃和pH 10时高于50％，优选高于55％，更优选高于60％，更优选高于65％，特别是高于70％。本专利技术第三方面涉及一种DNA构建体，其中含有的DNA序列编码有内切葡聚糖酶活性的酶，其最佳活性在85℃以上，优选90℃以上，更优选100℃以上，该DNA序列包含a)对应于可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列的内切葡聚糖酶编码部分的DNA序列，或b)对应于可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分的DNA序列的相似物，它i)与可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分相对应的DNA序列同源，优选至少60％同源，或ii)和可得自大肠杆菌DSM11201内质粒的DNA序列中内切葡聚糖酶编码部分相对应的DNA序列可杂交的相同寡核苷酸探针能够杂交，或者iii)编码一种多肽，该多肽与包含对应于可得自大肠杆菌DSM112本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种有内切－１，４－β－葡聚糖酶活性的酶制剂，它在高于８５℃的温度下有最佳活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M舒莱恩，ME别恩瓦德，IA诺莱旺，
申请(专利权)人：诺沃奇梅兹有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]