本发明专利技术的主题为切割DNA-RNA杂交物中RNA链的核糖核酸酶，其中核糖核酸酶包括含有RNA酶HI(RNA酶HI)的催化结构域或其衍生物与锌指DNA-RNA杂交结合结构域的融合蛋白，并且其中所述锌指结合结构域能够与DNA-RNA杂交物中的特异性序列结合。本发明专利技术还涉及用于确定DNA-RNA杂交物结合蛋白或其结构域的序列偏好的新方法，并允许确定经DNA-RNA杂交物中序列特异性结合蛋白识别的序列。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术的主题为切割DNA-RNA杂交物中RNA链的核糖核酸酶，其中核糖核酸酶包括含有RNA酶HI(RNA酶HI)的催化结构域或其衍生物与锌指DNA-RNA杂交结合结构域的融合蛋白，并且其中所述锌指结合结构域能够与DNA-RNA杂交物中的特异性序列结合。本专利技术还涉及用于确定DNA-RNA杂交物结合蛋白或其结构域的序列偏好的新方法，并允许确定经DNA-RNA杂交物中序列特异性结合蛋白识别的序列。【专利说明】序列特异性工程改造的核糖核酸酶H和用于确定DNA-RNA杂交物结合蛋白序列偏好的方法
本专利技术涉及序列特异性核糖核酸酶H，其包含工程改造的核糖核酸酶HI (RNA酶HI)结构域与锌指结构域的融合物。本专利技术可应用于遗传学。作用于DNA-RNA杂交物的序列特异性核糖核酸酶可用于任何应用，其中DNA-RNA杂交物中RNA链的切割可例如在核酸、特别是带有特定序列的DNA-RNA杂交物的体外操作中进行。除体外用途之外，以序列特异性方式切割DNA-RNA杂交物的酶还可发现在某些RNA病毒感染(例如致癌病毒、逆转录病毒、乙型肝炎、流行性感冒)的治疗中的用途，所述RNA病毒通过在RNA模板上瞬时形成DNA链来复制，或者切割在体内形成的其他DNA-RNA杂交物。本专利技术还涉及用于确定DNA-RNA杂交物结合蛋白或其结构域的序列偏好的方法并借此确定经DNA-RNA杂交物结合蛋白识别的序列。在此范围内的本专利技术可应用于遗传学。用于确定DNA-RNA杂交物结合蛋白的序列偏好的方法可应用于确定与DNA-RNA杂交物中的特异性序列结合的任何蛋白质或其结构域的序列偏好，并借此确定经DNA-RNA杂交物结合蛋白或其结构域识别的序列。所述方法可补充地用于这类蛋白质的任何特异性工程改造技术。序列特异性DNA-RNA杂交物结合蛋白可用于某些RNA病毒(例如致癌病毒、逆转录病毒、乙型肝炎、流行性感冒)的诊断，所述RNA病毒通过将RNA模板转换形成DNA链来复制。这样的结构域还可应用于蛋白质工程以获得具有新特异性的酶，例如DNA-RNA结合蛋白与酶促结构域(例如核酸酶、RNA修饰酶或DNA修饰酶等)的融合物。
技术介绍
在特定位置切割核酸常用于许多基因工程技术。有许多断裂DNA分子的方法，包括广泛使用的市购可得的限制性酶。已知的RNA加工酶不多并且其大多数表征为低序列特异性或完全缺失序列特异性。WO 2010076939 Al描述了使用嵌合的锌指核酸酶实施定向遗传重组或突变的组合物和方法。WO 03087341 A2描述了使用锌指核酸酶定向编辑人囊性纤维化跨膜传导调节因子基因，从而提供用于囊性纤维化的潜在疗法。WO 2009146179 Al描述了高效且易于实施的模块化装配方法的开发，其使用公开可得的锌指制备能够修饰人细胞中数个基因组位点的 DNA 序列的锌指核酸酶。WO 2010076939 AUffO 03087341 A2 或 WO 2009146179 Al都未描述或表明RNA酶HI或其部分与锌指、特别是与ZfQQR的融合物的用途，特别是它们也未公开或表明DNA-RNA杂交物的定向切割的可能性或者通过任何蛋白质对DNA-RNA杂交物的任何类型的定向切割的可能性。从说明书W02007014181A2和W02007014182A2中已知利于定向基因组编辑的许多锌指结构域与FokI核酸酶的融合物。然而，与前者情况不同，仅天然蛋白质(RNA酶HI和锌指)的融合物不产生序列特异性酶。用于确定DNA-RNA杂交物结合蛋白或其结构域的序列偏好并借此确定经DNA-RNA杂交物结合蛋白识别的序列的方法为SELEX程序的改进。SELEX代表通过指数富集的配体系统进化。此方法的原理是基于从很大差异的核酸序列文库中反复筛选和富集对配体表现出高亲和力的分子。富集步骤通过将核酸与配体结合并去除未结合的序列来完成。此方法目前用于获得以高特异性结合配体的RNA和DNA适体(Ellington, A.D.，Szostak,J.ff., 1990.Nature 346, 818 - 822; Huizenga DE, Szostak Jff.1995.Biochemistry34(2):656-65),用于确定DNA或RNA结合蛋白的序列偏好(Blackwell TK & Weintraub H.1990.Science 250:1104-1110)，但从未用于与DNA-RNA杂交物结合的蛋白质。用于已知的SELEX改进的所述寡核苷酸文库由单链寡核苷酸(RNA、ssDNA、修饰的RNA或修饰的ssDNA、PNA)或者双链DNA (dsDNA)组成，但未表征DNA-RNA杂交物文库的用途。WO 2010076939 Al描述了使用嵌合的锌指核酸酶实施定向遗传重组或突变的组合物和方法。WO 03087341 A2描述了使用锌指核酸酶定向编辑人囊性纤维化跨膜传导调节因子基因，从而提供用于囊性纤维化的潜在疗法。WO 2009146179 Al描述了高效且易于实施的模块化装配方法的开发，其使用公开可得的锌指制备能够修饰人细胞中数个基因组位点的DNA序列的锌指核酸酶。前述出版物均未描述SELEX法在确定DNA-RNA杂交物结合蛋白的底物偏好中的用途或者锌指在结合DNA-RNA杂交物中的特异性序列中的用途或者特别是ZfQQR在用于该目的中的用途。Herskovitz Μ.A.等，Mol Microbiol.2000 Dec: 38 (5): 1027-33，“Endoribonuclease RNAase III is essential in Bacillus subtilis (在枯草芽抱杆菌{Bacillus subtilis)中内切核糖核酸酶RNA酶III为必需的)。”描述了一种菌株的生长，其中Bs-RNA酶III (rncS)表达依赖于rncS自温度敏感型质粒的转录以及在非许可温度下导致90-95%细胞死亡，并且事实上幸存的全部细胞均保留了 rncS表达质粒。因此，作者推断rncS在枯草芽抱杆菌{B.subtilis)中为必需的。Dasgupta S.等,Mol Microbiol.1998; 28 (3): 629-40, “Genetic uncoupling of the dsRNA-binding and RNA cleavageactivities of the Escherichia coli endoribonuclease RNAase III—the effect ofdsRNA binding on gene expression (大肠杆菌 iBscherichia coli)内切核糖核酸酶RNA酶III的dsRNA结合活性和RNA切割活性的遗传解偶联——dsRNA结合对基因表达的影响)。”描述了在rnc中携带点突变的细菌表型，所述基因编码RNA酶III。Karen Shahbabian等，The EMBO Journal (2009) 28, 3523-3533， “ RNAase Y, a novel endoribonuclease,initiates riboswitch turnover in Baci本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：JM布尼基，AA苏勒，KJ斯科罗内克，M诺沃特尼，
申请(专利权)人：国际生物分子和细胞研究所，
类型：
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