一种穿透型TAT-TALEN蛋白及内源性基因被敲除的细胞的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种穿透型TAT-TALEN蛋白及内源性基因被敲除的细胞的制备方法和应用。穿透型TAT-TALEN蛋白是在TALEN蛋白的L链和R链的N端还具有细胞穿透多肽TAT，所述的细胞穿透多肽TAT的氨基酸序列为：N端-TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg-C端。本发明专利技术的穿透型TAT-TALEN蛋白能够敲除细胞内源性基因，尤其可以敲除细胞内源性CCR5基因，因此可将其应用于临床上艾滋病基因治疗中的CCR5基因敲除。应用本发明专利技术在对CCR5基因进行敲除的同时没有引入任何的外源基因，不存在随机插入到细胞的基因组中引起插入型突变的风险，并且TAT-TALEN蛋白进入细胞发挥作用后会逐渐被细胞降解不会一直存在于细胞内。

【技术实现步骤摘要】

: 本专利技术属于生物
，具体涉及一种穿透型TAT-TALEN蛋白及内源性基因敲除的细胞的制备方法和应用。
技术介绍
:艾滋病(AIDS)是由艾滋病病毒(HIV)感染引起的一种严重威胁人类健康的传染性疾病。研究表明CCR5是HIV入侵细胞最重要的共受体，世界上有一小部分人群的CCR5基因天然存在着32个碱基的缺失(CCR5 Δ 32)，他们不易被HIV感染且能够正常的生活。一位同时感染了 HIV的白血病人接受CCR5 Λ 32/Λ 32的供体造血干细胞(HSCs)骨髓移植，停止HAART治疗20个月后，没有出现病毒的反弹，随后观察到该病人免疫系统成功重建，病毒储存库随着时间的推移也在减小。这是世界首例通过干细胞移植获得治愈的艾滋病患者。但这种治疗手段并不能广泛应用，因为CCR5 Δ 32纯合子的人只有极少的一部分，难以找到同配型的CCR5 Δ 32供体进行骨髓造血干细胞移植。以转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)为代表的基因打靶技术可以实现指定基因的靶向性敲除。利用这种技术即可以人为的将野生型的CCR5突变为失活型的CCR5。艾滋病的干细胞治疗策略即变成了利用类似于TALEN这种核酸酶工具敲除艾滋病病人体内造血干细胞内的CCR5基因再进行自体造血干细胞移植。近期的研究表明，多能诱导干细胞(iPSCs)因为来源广泛，易于在体外长期培养，且敲除了 CCR5基因的iPSCs能够定向分化成具有全能型的造血干细胞，可作为获取CCR5缺失型造血干细胞的一种替代选择，很有应用前景。但不管是直接敲除HSCs内的CCR5基因，还是先敲除人的iPSCs内的CCR5基因再间接获得CCR5缺失型的造血干细胞，都需要将TALEN输送到细胞中进行基因敲除。而现有的以病毒或者质粒为载体输送TALEN的方法有可能引起细胞内基因的插入型突变，对于临床上的使用并不安全
技术实现思路
:本专利技术的第一目的是提供一种能够敲除细胞内源性基因的穿透型TAT-TALEN蛋白。本专利技术能够敲除细胞内源性基因的穿透型TAT-TALEN蛋白，其特征在于，其是在TALEN蛋白的L链和R链的N端还具有细胞穿透多肽TAT，所述的细胞穿透多肽TAT的氨基酸序列为:N 端-TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg-C 端。上述穿透型TAT-TALEN蛋白在敲除细胞内源性基因中的应用。编码上述能够敲除细胞内源性基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链的核苷酸序列。为了针对内源性CCR5基因，本专利技术的能够敲除细胞内源性CCR5基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链是由SEQ ID N0.1所示序列的碱基编码的，穿透型TAT-TALEN蛋白的R链是由SEQ ID N0.2所示序列的碱基编码的。该穿透型TAT-TALEN蛋白能敲除细胞内源性CCR5基因而在制备艾滋病基因治疗药物中应用。一种内源性CCR5基因被敲除的细胞的制备方法，其特征在于，将编码上述能够敲除细胞内源性CCR5基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链的核苷酸序列分别插入原核表达载体中，然后原核表达出能够敲除细胞内源性CCR5基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链，将穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链与含有内源性CCR5基因的细胞孵育以敲除CCR5基因，从而得到内源性CCR5基因被敲除的细胞。所述的孵育优选为将穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链与含有CCR5基因的细胞在37°C孵育I小时，用细胞完全培养基更换细胞培养液以去除穿透型TAT-TALEN蛋白，再在30°C常规培养24小时，再与穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链混合37°C孵育I小时，再用细胞完全培养基更换细胞培养液以去除穿透型TAT-TALEN蛋白，再在30°C常规培养24小时,如此再重复一次。本专利技术所述的TALEN蛋白是指转录激活因子样效应因子核酸酶，其包括TALEN L链和R链。本专利技术的穿透型TAT-TALEN蛋白能够敲除细胞内源性基因，尤其可以敲除细胞内源性CCR5基因，因此可将其应用于临床上艾滋病基因治疗中的CCR5基因敲除。应用本专利技术在对CCR5基因进行敲除的同时没有引入任何的外源基因，不存在随机插入到细胞的基因组中引起插入型突变的风险，并且TAT-TALEN蛋白进入细胞发挥作用后会逐渐被细胞降解不会一直存在于细胞内。由此可见本专利技术可以简单安全的敲除细胞内源性CCR5基因，可以作为艾滋病治疗的药物，用于艾滋病的基因治疗中。附图说明图1是构建的 TAT-TALEN蛋白结构示意图；其中:standard TALEN L/R:未经改造的标准转录激活子样效应因子核酸酶；TAT-TALEN L/R:TAT修饰的转录激活子样效应因子核酸酶；His:6组氨酸纯化标签；TAT:细胞穿透肽TAT短肽；NLS:核定位序列；transcription activator-like domain:转录激活子样结构域；FokI:FokI 核酸酶结构域。图2是最终纯化获得的TALEN蛋白SDS-PAGE检测图；其中:TALEN L:TALEN蛋白的 L 链；TALEN R: TALEN 蛋白的 R 链；TAT-TALEN L: TAT-TALEN 蛋白的 L 链;TAT_TALENR:TAT-TALEN 的 R 链。图3是所纯化的TALEN蛋白体外活性检测:其中，standard TALENs =TALEN L与TALEN R 构成的一对 TALEN ;TAT_TALENs:TAT-TALEN L 与 TAT-TALEN R 构成的一对 TALEN ；substrate:PCR扩增的包含TALEN识别位点的CCR5片段；products =TALEN特异性酶切CCR5片段得到的产物。图4是对所纯化的TALEN蛋白穿透细胞的Western blot检测:其中:pre-transduction lysate:在与蛋白进行孵育前的细胞样品；post_transductionlysate:在与蛋白进行孵育后的细胞样品；TALEN L:与TALEN L孵育后的细胞样品；TALENR:与TALEN R孵育后的细胞样品；TAT-TALEN L:与TAT-TALEN L孵育后的细胞样品；TAT-TALEN R:与TAT-TALEN R孵育后的细胞样品；GAPDH:内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶。图5是TALEN或TAT-TALEN蛋白与Hela细胞和hiPSCs细胞孵育后对细胞内源性CCR5基因被敲除情况的Surveyor酶切检测结果。图6是TAT-TALEN蛋白处理后的HeLa细胞基因组CCR5的测序结果比对:其中:WT:野生型的CCR5序列deletions:TAT-TALEN切割靶序列后细胞进行DNA修复引入的核苷酸缺失insertions:TAT-TALEN切割靶序列后细胞进行DNA修复引入的核苷酸插入。具体实施例方式为使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1:利用穿透型TAT-TALEN蛋白敲除HeLa细胞及hiPSCs细胞内源性CCR5基因。 标准型TALEN和TAT-TALEN原核表达载体的构建(图1)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够敲除细胞内源性基因的穿透型TAT?TALEN蛋白，其特征在于，其是在TALEN蛋白的L链和R链的N端还具有细胞穿透多肽TAT，所述的细胞穿透多肽TAT的氨基酸序列为：N端?TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg?C端。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小平，姚永超，汝任礼，余松林，秦莉，谭学方，赵思婷，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：