本发明专利技术提出了一种源自米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC?40186菌株的新型木聚糖酶基因序列的克隆方法，其核苷酸序列为SEQ?ID?NO：1。生物信息学分析表明该木聚糖酶属于糖苷水解酶第11家族，命名为Aor?Xyn11A，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO：2，相应的基因命名为Aor?xyn11A。本发明专利技术还公开了Aor?Xyn11A工程菌的构建以及重组Aor?Xyn11A的高效表达和纯化的方法，制备的重组Aor?Xyn11A的最适作用温度和pH分别为50℃和5.5，在pH?4.5-7.5、40℃以下稳定，具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
【技术实现步骤摘要】
,4-内切木聚糖酶(Aor Xyn11A)基因的克隆及重组酶的制备的制作方法
本专利技术涉及源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的一种糖苷水解酶11家族的木聚糖酶基因序列的克隆，木聚糖酶工程菌的构建以及重组木聚糖酶的高效表达和纯化的方法，属于生物工程
技术介绍
纤维素、半纤维素和木质素是植物细胞壁的主要成分，而木聚糖是植物半纤维素的重要组成部分，它是继纤维素之后含量第二丰富的可再生生物资源。木聚糖酶是降解木聚糖的一组酶的总称，由于木聚糖的来源不同，其结构的复杂性也不同，它的完全降解需要多种水解酶的参与共同作用完成，如内切木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、葡糖糖醛酸酶以及α-L-阿拉伯呋喃糖酶等。其中最重要的是，4_内切木聚糖酶(endo-β-Ι， 4-xylanase, EC 3. 2. 1. 8)，它能从木聚糖主链的内部随机切割木糖苷键，将其降解成寡聚木糖、木二糖和少量木糖，是半纤维素类资源转化和利用不可缺少的生物催化剂。大多数微生物木聚糖酶都是单亚基蛋白，不同微生物来源的木聚糖酶等电点各不相同，大多数β -ι， 4-内切型木聚糖酶的最适ρΗ值为4. O 7. 0，ρΗ稳定范围为3. O 10. O ；最适反应温度在 40°C 75°C之间。通常真菌木聚糖酶比细菌木聚糖酶的温度稳定性差，而且真菌木聚糖酶的最适PH值更偏酸性。木聚糖酶在各方面的应用很广泛，比如在饲料工业、造纸工业、生物能源、食品与医药工业等方面。现在国内外对木聚糖酶的研究主要集中在两个方面，一方面是研究如何提高木聚糖酶的表达水平，以期在工业生产中推广应用。另一方面是对木聚糖酶进行基因改造，改善其酶学性质，使之更适合工业应用要求。但就国内外相关文献或专利报道来看， 微生物木聚糖酶发酵酶活性普遍不高，导致了生产成本很高，从而阻碍了该酶在众多领域中的广泛应用。为了提高木聚糖酶的发酵产率和酶活性，早期的研究工作主要集中在产酶菌种的筛选、诱变、产酶诱导，酶的分离纯化及性质，酶水解底物方式及应用等方面。进入 90年代，随着基因工程技术和蛋白质工程技术的广泛应用，研究工作逐步转向酶基因的克隆和表达以及酶活性位点的研究等方面。目前，虽已有一些有关木聚糖酶基因的克隆和表达的文献和专利报道，但有关来源于米曲霉木聚糖酶基因的克隆和表达等的研究未见有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株新型木聚糖酶基因序列克隆，木聚糖酶工程菌的构建以及重组木聚糖酶的高效表达和纯化的方法。生物信息学分析表明，来源于A.0ryZae CICC 40186菌株的一种新型壳聚糖酶属于糖苷水解酶第11家族，命名为Aor XynllA，其相应的基因命名为iVorxynllA。Aor XynllA具有较高的催化活性和热稳定性，有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值。本专利技术的技术方案一种源自A.oryzae CICC 40186菌株新型iVor XynllA基因的核苷酸序列分别为SEQ ID NO=I0A. oryzae菌株从中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)购买。所述的由完整mRNA序列推导的iVor XynllA氨基酸序列为SEQ ID NO :2。所述的重组iVor XynllA的活性测定方法于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 4. 6、柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液配制的质量浓度为0.5%的桦木木聚糖溶液2. 4mL，50°C预热lOmin，在A管中加入0. ImL适当稀释的酶液，50°C准确反应20min ；立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B 管中再补加0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ；冷却后各加去离子水5mL，摇勻；540nm处以 B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以木糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义在本测定条件下，以每分钟产生1 μ mol还原糖所需的酶量定义为1个壳聚糖酶活性单位(U)。所述的^VorxynllA完整mRNA序列的克隆和表达方法(I)Aor xynllA 3'端 mRNA 序列的克隆首先对 Aspergillus terreus (GenBank XP_001216082. 1) 、Aspergillus clavatus(GenBank XP_001273773. 1) 、Aspergillus fumigatus(GenBank XP_748354. 1)和 Aspergillus niger(GenBank AAM08362. 1)GH11 的木聚糖酶序列进行同源比对，找出两段7个氨基酸的保守序列；再对该两段氨基酸序列的 mRNA进行同源比对，设计两条正向简并引物XynFl和XynF2。XynFl :5，-TACTA(C/T)TCCTTCTGGAC(C/T)GA-3，XynF2 5，-GGCAACTTTGTCGG(C/T)GG(G/A)A-3，提取A.oryzae CICC 40186 的总 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)说明书进行RT-PCR扩增。将两轮PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-XynllA3')，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aor xynllA 3'端mRNA序列。(2)Aor xynllA 5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的iVor xynllA 3'端mRNA 序列，设计两条反向引物XynRl和XynR2。XynRl TCCGGAGTAGGTGATTGCTCTXynR2 CCATCCTTTCCCGCCGACGA按照TaKaRa 5' -Full RACE Kit说明书进行5' -RACE。将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-XynllA5')，转化JM109， 经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aor xynllA 5'端mRNA序列。(3) Aor xynllA的生物信息学分析将Aor xynllA的5‘和3‘端mRNA序列进行拼接，得到自转录起始位点至Poly(A)完整的mRNA序列；在NCBI上对开放阅读框架(Open Reading Frame)进行分析，进而推导出Aor XynllA的氨基酸序列；进行信号肽预测。(4)含编码iVor XynllA成熟肽基因的表达质粒的构建基于上述得到的^Vor xynllA完整mRNA序列以及预测的信号肽序列，设计一条正向引物XynF3和一条反向引物 XynR30XynF3 5' ~GAATTCTCCACACCCAGTAGCAC~3 ‘，含 EcoR I 酶切位点XynR3 5' ~GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG~3 ‘，含 Not I 酶切位点按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)使用说明书进行 RT-PCR。以 Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和X本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邬敏辰，史红玲，张慧敏，高树娟，李剑芳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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