使用工程化锌指蛋白核酸酶靶向断裂T细胞受体基因制造技术

本文公开用于修饰TCR基因的方法和组合物，其使用核酸酶(锌指核酸酶或者TAL核酸酶)来修饰TCR基因。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用工程化锌指蛋白核酸酶靶向断裂T细胞受体基因相关申请的交叉引用本申请要求在2013年3月21日提交的美国临时申请号61/804,076的优先权，据此该申请的公开内容通过引用整体并入。
本公开内容是在人类细胞的基因组修饰领域中，该人类细胞包括淋巴细胞和干细胞。专利技术背景已经描述用于基因组DNA靶向切割的各种方法和组合物。此类靶向切割事件可用于例如诱导靶向诱变、诱导细胞DNA序列的靶向缺失，以及促进在预先决定的染色体位点处的靶向重组。参见，例如美国专利号7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；8,586,526；美国专利公开20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060063231；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960，以及美国临时申请号61/823,689，这些申请的公开内容通过引用整体并入用于所有目的。这些方法往往涉及使用工程化切割系统来诱导靶向DNA序列中的双链断裂(DSB)或者缺口，以便用诸如非同源端连接(NHEJ)的错误倾向过程(errorbornprocess)对断裂的修复或者使用修复模板(同源介导的修复或即HDR)进行的修复可导致基因敲除或受关注序列的插入(靶向整合)。可通过使用特异性核酸酶进行切割，如工程化锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)，或者使用具有工程化crRNA/tracrRNA(‘单导向RNA’)的CRISPR/Cas系统来导向特异性切割。T细胞受体(TCR)是选择性激活T细胞的关键部分。与抗体有些类似，TCR一般是由两条链，即α和β组成的，该两条链共同装配而形成杂二聚体。抗体类似处在于编码TCR链的单一基因放在一起的方式。TCR链是由两个区域组成，即C端恒定区和N端可变区。编码TCR链的基因座与编码抗体的基因座的类似处在于TCRα基因包括V区段和J区段，而β链基因座除V区段和J区段之外还包括D区段。在T细胞发育期间，各种区段重组，以便每一T细胞具有唯一的TCR结构并且人体具有大量的T细胞，T细胞由于它们唯一的TCR结构而能够与由抗原递呈细胞显示的唯一抗原相互作用。另外，TCR复合物构成T细胞上的CD3抗原复合物的一部分。在T细胞激活期间，TCR与在抗原递呈细胞的主要组织相容性复合物(MHC)上显示为肽的抗原相互作用。TCR对抗原-MHC复合物的识别导致了T细胞刺激，该T细胞刺激反过来导致记忆淋巴细胞和效应淋巴细胞中T辅助细胞(CD4+)和细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)的分化。然后，这些细胞可以克隆方式扩增，以在能够对一种特定抗原作出反应的整个T细胞群体中提供被激活的亚群。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)被认为在杀伤肿瘤细胞中是关键的。这些细胞一般能够在癌细胞表面上显示出先前由抗原递呈细胞显示在MHC上的一些抗原时诱导癌细胞的凋亡。通常，在对靶细胞作用之后，当细胞威胁被清除时CTL将会凋亡，而保留的淋巴细胞的亚组将进一步分化成记忆T细胞存留，以防止人体再次暴露于抗原。记忆淋巴细胞池可能是高度异质的。近来，已经鉴别了两种类型的记忆T细胞：效应记忆T细胞(CD45RA-CCR7-，CD62L-)和中枢记忆T细胞，中枢记忆T细胞是特征为表达CCR7和CD62L的CD45RA阴性细胞，CCR7和CD62L是在次级淋巴器官的T细胞区中归巢所需要的两种分子。在抗原刺激时，中枢记忆T细胞产生低水平的效应细胞因子如IL-4和IFN-γ，但是高水平的IL-2，这能够支持中枢记忆T细胞的快速和一致的增殖。在遇到抗原时，中枢记忆T细胞经历：1)增殖，导致自动再生过程，目的在于增大中枢记忆T细胞池；以及2)分化，导致效应记忆T细胞的生成，效应记忆T细胞特征为低增殖潜能但是能够迁移到发炎的非淋巴组织并且介导免疫反应的效应期。已经研发出能基因转移到T淋巴细胞，同时保持基因的中枢记忆功能表型的方案(参见，欧洲专利公开号EP1956080，Kaneko等人，2009Blood113(5)：1006-15)。然而，一些肿瘤细胞能够或许通过诸如表达相关TCR的某些CTL亚组的不良克隆扩增和由癌细胞局限免疫抑制的机制来逃避免疫系统的监视(参见，Boon等人(2006)，AnnuRevImmunol，24：175-208)。癌症疫苗的概念是基于以下理念构建的：使用这些癌症特异性抗原来刺激和扩增在体内表达适当TCR的CTL，以试图克服免疫逃避，然而这些癌症疫苗尚未显示出任何显著的成果。事实上，在2004年进行的分析研究765位已经在超过35个不同的癌症疫苗试验中接受治疗的转移癌患者，其中仅在3.8％的患者中观察到总反应(参见，Rosenberg等人(2004)，Nat.Med.，10(9)：909–915)。过继性免疫疗法是以下实践：实现高度特异性T细胞对某些具有针对肿瘤抗原的高亲合力TCR的CTL亚群的刺激，在体外刺激和扩增亚群，以及然后将亚群导入患者体内。如果在输注肿瘤特异性细胞之前从患者体内去除天然淋巴细胞，则过继性免疫疗法尤其有效。这种类型的疗法背后的理念是：如果所导入的高亲合力CTL奏效，则一旦肿瘤被清除，这些细胞中的一些将作为记忆T细胞保留并且将存留在患者体内以防癌症复发。在2002年完成的一项研究表明在用环磷酰胺和氟达拉滨进行免疫耗竭后，以过继性免疫疗法方案治疗的患者的转移性黑素瘤退变(Dudley等人，(2002)Science，298(5594)：850-854)。如果在过继性免疫疗法之间进行全身照射，则应答率会甚至更高(Dudley等人，2008，JClinOncol，26(32)：5233-9)。然而，当包含高亲合力TCR的受关注T细胞不能轻易扩增时，无法进行过继性免疫疗法。此外，往往难以从癌症患者鉴别和分离有治疗价值的T细胞，这是因为肿瘤抗原往往是自体抗原，针对肿瘤抗原的患者免疫系统通过那些具有最高亲合力的T细胞克隆的缺失或者无反应性的机制而变得耐受。因此，已经建议和证明将编码高亲合力的TCR的基因转移到来源于患者的T细胞中(参见，Rubenstein等人，(2003)JofImmunology，170：1209-1217)。最近，使用恶性黑素瘤的小鼠模型，在导入已经用携带gp-100黑素瘤抗原特异性人类TCR基因的逆转录病毒载体转导过的正常淋巴细胞之后，发现具有统计上显著的肿块质量减少(Abad等人，(2008)JImmunother，31(1)：1–6)。TCR基因疗法还在Morgan等人(2006)Science314(5796)：126-9和Burns等人，2009Blood114(14)：2888-99中有所描述。然而，任何TCR转基因到宿主T细胞中的转移带有与大多数的基因转移方法相关联的警告，即TCR转基因表达盒未调节和无法预见的插入到基因组中，插入往往是低水平的。此类控制不良的所需转基因的插入可导致转基因对周围基因的影响，以及由于来自邻近基因的影响导致的转基因沉默。此外，在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的T淋巴细胞，其包含稳定整合的、编码T细胞受体(TCR)的外源序列，其中所述细胞中的至少一个内源TCR基因由锌指核酸酶或者TALEN部分或者完全地钝化，所述TALEN包括TAL效应DNA结合域和切割域，以及此外其中所述TAL效应DNA结合域相较于野生型TAL效应DNA域包含C端截断。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.21 US 61/804,0761.一种分离的T淋巴细胞，其包含稳定整合的、编码T细胞受体α(TRAC)的外源序列，其中所述细胞中的至少一个内源TRAC基因由TALEN部分或者完全地钝化，所述TALEN包括TAL效应DNA结合域和切割域，所述结合域结合SEQIDNO:147-149中所示的靶位，其中所述TAL效应DNA结合域相较于野生型TAL效应DNA域包含C端截断。2.如权利要求1所述的分离的T淋巴细胞，其中，内源TCRβ基因被钝化。3.如权利要求2中所述的分离的T淋巴细胞，其中，所述TCRβ基因被结合SEQIDNO:150-153中所示靶位的TALEN钝化。4.如权利要求1所述的分离的T淋巴细胞，其中使用整合酶缺陷的慢病毒载体(IDLV)、AAV、质粒或者mRNA将编码所述TALEN的多核苷酸导入所述细胞。5.如权利要求1所述的分离的T淋巴细胞，其中将所述外源序列导入内源TCR基因、CCR5基因或者AAVS1基因。6.如权利要求1所述的分离的T淋巴细胞，其中所述外源序列还包含肿瘤抗原特异性TCRβ转基因。7.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·D·格雷戈里，M·C·霍尔姆斯，D·帕斯乔恩，张雷，M·C·伯尼尼，P·格诺韦塞，Z·马格纳尼，S·马斯塔格里奥，L·那尔蒂尼，
申请(专利权)人：桑格摩生物科学股份有限公司，圣拉斐尔医院有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US