用于治疗遗传病状的方法和组合物技术

本文公开用于遗传修饰，例如用于治疗疾病或用于产生遗传修饰植物的方法和组合物。在一个方面，本文描述了一种修改细胞中的内源性基因的方法，包括以下步骤：向细胞施用包含识别内源性基因中的靶位点的单导向RNA的第一核酸分子和编码功能性结构域的第二核酸分子，其中所述功能性结构域与所述靶位点上的所述单导向RNA缔合，由此修改所述内源性基因的表达。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2013年5月15日提交的美国临时申请号61/823,689的权益，所述美国临时申请的公开内容据此以引用的方式整体并入本文。
本公开属于基因组工程领域。背景基因疗法对于实现人类医学的新纪元来说持有巨大潜力。这些方法将允许治疗迄今为止尚未可通过标准医学实践解决的病状。尤其有前途的一个领域是能够遗传工程改造细胞以使该细胞表达先前尚未在该细胞中产生的产物。使用这个技术的实例包括插入编码新型治疗性蛋白质的转基因、插入编码在细胞中或在个体中缺乏的蛋白质的编码序列、在含有突变基因序列的细胞中插入野生型基因、以及插入编码结构核酸(如微小RNA或siRNA)的序列。为迎接对粮食产量的全球性需求日益增加的挑战，许多有效用以改进农业生产率(例如增强产率或工程改造害虫抗性)的方法依赖于突变育种或通过转化将新型基因引入作物物种的基因组中。两种方法均固有地是非特异性的以及相对低效的。举例来说，常规植物转化方法递送外源性DNA，其在随机位置处整合至基因组中。这些方法的随机性质使得必需产生以及筛选每个构建体的数百个独特随机整合事件以鉴定和分离具有合乎需要属性的转基因株系。此外，常规转化方法产生关于转基因评估的若干挑战，包括：(a)难以预测是否已发生归因于非故意基因组破坏的多效性效应；以及(b)难以比较不同调控元件和转基因设计在单一转基因候选物内的影响，因为此类比较因随机整合至基因组中而复杂。因此，常规植物性状工程改造是艰巨且成本密集性过程，具有低成功概率。精确基因修饰克服在植物系统中进行常规实践的逻辑挑战，并且因此已成为基础植物生物学研究与农业生物技术两者中的长期但难以捉摸的目标。然而，除通过在稻中阳性-阴性药物选择或使用预先工程改造的限制位点进行的“基因靶向”之外，在所有植物物种(模型与作物两者)中的靶向基因组修饰直到最近都已被证明极其困难。Terada等(2002)NatBiotechnol20(10):1030；Terada等(2007)PlantPhysiol144(2):846；D'Halluin等(2008)PlantBiotechnologyJ.6(1):93。转基因(或性状)堆积对于产生植物来说具有极大潜力，但已被证明是困难的。参见例如Halpin(2005)PlantBiotechnologyJournal3:141-155。此外，多倍性(其中生物体具有两组或更多组复制(同源倍体)或相关(异源倍体)的成对染色体组)在植物物种中比在动物中更常存在。举例来说，小麦具有是二倍体(两组染色体)、四倍体(四组染色体)和六倍体(六组染色体)的株系。此外，芸苔属(Brassica)的许多在农业上重要的植株也是异源四倍体。转基因可通过多种方式递送至细胞中，以使转基因变为整合至细胞的自身基因组中，并且得以在其中维持。近年来，已开发一种用于转基因整合的策略，其使用用位点特异性核酸酶进行的裂解以靶向插入所选基因组基因座中(参见例如共同拥有的美国专利7,888,121)。可利用对靶向基因具有特异性的核酸酶以使通过同源性定向修复(HDR)或通过在非同源末端连接(NHEJ)驱动过程期间的末端捕获来插入转基因构建体。靶向基因座包括“安全港(safeharbor)”基因座，如人细胞中的AAVS1、HPRT和CCR5基因以及鼠类细胞中的Rosa26(参见例如美国专利号7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；8,586,526；美国专利公布20030232410；20050208489；20050026157；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960)和植物中的Zp15基因座(参见美国专利U.S.8,329,986)。相较于依赖于转基因的随机整合的经典整合方法，核酸酶介导的整合提供转基因表达改进、安全性和表达耐久性增加的前景，因为它允许精确转基因定位以使基因沉默或邻近致癌基因活化的风险最小。除上述插入方法之外，基因组工程改造也可包括基因敲除。在不存在供体核酸下，基因组被裂解的细胞将借助易出错的NHEJ路径来愈合断裂。这个过程常在修复过程期间添加或缺失核苷酸(“插入缺失”)，此可导致在靶位点处引入错义或无义突变。举例来说，CCR5特异性锌指核酸酶正用于I/II期试验中以产生非功能性CCR5受体，并且因此预防HIV感染(参见美国专利7,951,925)。可通过使用工程改造的核酸酶在所需位置处获得靶向核酸酶介导的基因组裂解。举例来说，可通过位点特异性核酸酶，如锌指核酸酶(ZFN)或TAL效应物结构域核酸酶(TALEN)来产生双链断裂(DSB)。参见例如Urnov等(2010)Nature435(7042):646-51；美国专利号8,586,526；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054，其公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。另一核酸酶系统涉及使用见于细菌和古细菌中的称为CRISPR/Cas系统的所谓获得性免疫系统。CRISPR/Cas系统见于40％的细菌和90％的古细菌中，并且在它们的系统的复杂性方面有差异。参见例如美国专利号8,697,359。CRISPR基因座(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat(成簇规律间隔的短回文重复序列))是生物体的基因组内的区域，其中可将外来DNA的短区段整合在短重复回文序列之间。这些基因座被转录，并且RNA转录物(“前crRNA”)被加工成短CRISPRRNA(crRNA)。存在三种类型的CRISPR/Cas系统，其全都包含这些RNA和称为“Cas”蛋白(CRISPRassociated(CRISPR相关))的蛋白质。I型与III型两者均具有加工前crRNA的Cas核酸内切酶，所述前crRNA在被完全加工成crRNA时装配能够裂解与crRNA互补的核酸的多Cas蛋白质复合物。在II型系统中，使用不同机制产生crRNA，其中与前crRNA中的重复序列互补的反式活化RNA(tracrRNA)触发由双链特异性RNA酶III在Cas9蛋白存在下进行加工。Cas9接着能够裂解与成熟crRNA互补的靶DNA，然而，由Cas9进行的裂解依赖于cr本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修改细胞中的内源性基因的表达的方法，所述方法包括以下步骤：向所述细胞施用包含识别所述内源性基因中的靶位点的单导向RNA的第一核酸分子和编码功能性结构域的第二核酸分子，其中所述功能性结构域与所述靶位点上的所述单导向RNA缔合，由此修改所述内源性基因的表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.05.15 US 61/823,6891.一种修改细胞中的内源性基因的表达的方法，所述方法包括以下步骤：向所述细胞
施用包含识别所述内源性基因中的靶位点的单导向RNA的第一核酸分子和编码功能性结构
域的第二核酸分子，其中所述功能性结构域与所述靶位点上的所述单导向RNA缔合，由此修
改所述内源性基因的表达。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述功能性结构域选自由以下组成的组：转录活化结
构域、转录阻抑结构域和核酸酶结构域。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述功能性结构域是IIS型限制酶核酸酶结构域或
Cas蛋白。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述功能性结构域是转录活化结构域，并且所述内源
性基因的表达得以增加。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述功能性结构域是转录阻抑结构域，并且所述内源
性基因的表达受抑制。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述功能性结构域是核酸酶，并且所述内源性基因被
裂解。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述核酸酶结构域被所述Cas蛋白包含。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述Cas蛋白包含一个多个核酸酶裂解结构域。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物或植物细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是干细胞。
11.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述内源性基因选自由以下组成的组：
哺乳动物β球蛋白基因(HBB)、γ球蛋白基因(HBG1)、B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)基
因、Kruppel样因子1(KLF1)基因、CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(AAVS1)基因、次黄嘌呤磷
酸核糖基转移酶(HPRT)基因、白蛋白基因、因子VIII基因、因子IX基因、富含亮氨酸的重复
序列激酶2(LRRK2)基因、亨廷顿蛋白(Htt)基因、视紫红质(RHO)基因、囊性纤维化跨膜传导
调控子(CFTR)基因、表面活性蛋白B基因(SFTPB)、T细胞受体α(TRAC)基因、T细胞受体β
(TRBC)基因、程序性细胞死亡1(PD1)基因、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)基因、人白细<...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·康威，G·J·柯斯特，R·迪克勒弗，E·J·瑞巴，A·瑞克，F·诺弗，汪建斌，H·S·张，
申请(专利权)人：桑格摩生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US