一种筛选线粒体基因组编辑工具靶向目标序列的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选线粒体基因组编辑工具靶向目标序列的方法，属于基因组工程领域。所述筛选方法具体如下：利用转基因技术，构建了一个核基因组中含有线粒体DNA(mtDNA)序列片段或片段组合的转基因细胞系。将含有相应mtDNA靶向目标序列的基因组编辑技术作用质粒转染到该细胞系中，经合适作用时间，利用相应基因组编辑技术靶向剪切活性的鉴定方法检测待选mtDNA靶向目标序列的剪切活性，从中筛选合适mtDNA靶向目标序列。建立了一种筛选线粒体基因组编辑工具靶向目标序列的方法。该方法简便易行，具有普遍适用性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因组工程领域，具体地说，涉及一种筛选线粒体基因组编辑工具靶向目标序列的方法。
技术介绍
随着测序技术的不断发展，我们获得越来越多的遗传信息。研究人员试图通过对特定靶向基因的破坏或敲除来研究它们的相关功能。与传统基因打靶技术相比，新型基因组编辑技术应用范围更广、作用效率更高、所需成本更低，可用于模式动物构建、基因功能研究、基因治疗等方面。目前，常用的基因组编辑技术主要包括以下三种：锌指蛋白(zincfingerproteins，ZFPs)技术、转录激活因子样效应因子(transcriptionactivator-likeeffectors，TALEs)技术、CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)技术。它们的大致原理都是通过造成靶向DNA双链断裂(double-strandbreaks，DSBs)，引发细胞内固有的非同源末端连接(nonhomologousendjoining，NHEJ)或同源重组(homology-directedrepair，HDR)两种修复机制对DSBs处进行修复，引入插入或缺失突变。三种技术在具体操作方式上又有所不同：锌指核酸酶(zinc-fingernuclease，ZFN)与转录激活子样效应因子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN)这两种人工核酸内切酶，均由DNA识别域与非特异性核酸内切酶FokI融合而成。其中，ZFN的锌指模块识别三联体碱基，在序列的识别上灵活性小，设计成本昂贵、技术被少数公司垄断，这些都限制了它的发展。TALEN在结构上较之ZFN更加优化。其DNA结合域中的各单元可与靶向目标序列一一对应，组装更为简单，特异性更高。2013年，一种源自细菌适应性免疫系统的CRISPR/Cas9的出现，为基因靶向修饰领域带来了巨大变革。它的主要原理：向导RNA(guideRNA，gRNA)与Cas9核酸酶形成的复合物，在gRNA指导下与靶向目标序列结合，由靶向目标序列下游的原型间隔序列相邻基序(protospaceradjacentmotifs，PAM)激活Cas9核酸酶，使其对PAM上游3nt处剪切造成DSBs。该系统较之前两种，应用范围更广、作用效率更高、使用成本更低，经过短短两年的发展，已被用于世界各地的实验室。线粒体是存在于大多数真核生物细胞中的细胞器，有“细胞中的能量工厂”之称。它主要通过氧化磷酸化以三羧酸循环腺苷(ATP)的形式为细胞活动提供能量。线粒体基因组，又称线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)。长度一般为几万至数十万碱基对，人类mtDNA为16,569bps，共编码2个rRNA、13个多肽、22个tRNA。基因排列紧凑，除与mtDNA复制及转录有关的一小段区域外，无内含子序列。mtDNA表现为母系遗传，突变率高，是细胞核内DNA的10倍左右。且mtDNA突变是导致人类线粒体遗传病及衰老性疾病的重要原因之一。研究表明，它与衰老及神经退行性病变如阿尔茨海默症、帕金森氏病等老年化疾病有关，同时也与肿瘤的形成密切相关。截至目前，已鉴定出超过500多个致病性突变来自mtDNA，而针对mtDNA致病性突变的精确改造能力则相对缺乏。随着MichalMinczuk等将ZFN作用于mtDNA，SandraRBacman等首次将TALEN用于清除病人线粒体内的突变型mtDNA。这两种基于ZFPs技术、TALEs技术的线粒体基因组编辑工具都为更好的进行线粒体功能研究、线粒体遗传病的治疗等提供了可能。此外，本实验室也基于人工CRISPR/Cas9系统独特地构建了作用于mtDNA的mtCRISPR/Cas9系统，作为新型线粒体基因组编辑工具作用于mtDNA。任何一种基因组编辑技术，它的靶向剪切效率、切割特异性等问题不可回避。由于核基因组中的DNA损伤修复系统比较完整，当发生DSBs时，可通过NHEJ修复在靶向目标序列处引入插入或缺失突变。因此，靶向修饰核基因组的相关基因组编辑技术可通过错配酶法、靶向目标序列直接PCR后TA克隆测序或观察靶向目标序列测序峰图等方法鉴定。而相应的线粒体基因组编辑工具，由于线粒体缺乏完善的DNA损伤修复系统，修复能力较弱，无法通过上述方法检测。本专利技术，利用转基因技术将一段含有待选靶向目标序列的mtDNA序列片段或片段组合整合到宿主基因组中，获得转基因细胞株。通过相应基因组编辑技术靶向剪切活性的鉴定方法检测待选mtDNA靶向目标序列的剪切活性，从中筛选合适mtDNA靶向目标序列。建立了一种筛选线粒体基因组编辑工具靶向目标序列的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种筛选线粒体基因组编辑工具靶向目标序列的方法。本专利技术基于转基因技术，构建了一个核基因组中含有线粒体DNA(mtDNA)序列的转基因细胞系。利用相应基因组编辑技术靶向剪切活性的鉴定方法检测待选mtDNA靶向目标序列的剪切活性，从中筛选合适mtDNA靶向目标序列。本专利技术提供了一种转基因细胞系的构建方法。所述转基因细胞系构建的主要流程：构建一个含有mtDNA序列的重组克隆质粒，将该质粒转染于作用细胞后(或线性化后转染)，经适宜浓度的药物筛选(或其它方法)，使这段mtDNA序列随机整合到宿主基因组中，挑选单拷贝或低拷贝的单克隆转基因细胞株用于检测待选mtDNA靶向目标序列的剪切活性，从中筛选合适mtDNA靶向目标序列。所述转基因细胞系的构建，可将一个或多个待选mtDNA靶向目标序列、潜在脱靶序列、定点整合所需同源臂序列或其它序列片段(或片段组合)连入克隆载体质粒中，并将这段序列整合到宿主基因组中，构建转基因细胞系。所述克隆载体质粒，可以为哺乳动物细胞表达载体pEGFP-N1，也可以为其它真核表达载体。所述重组克隆质粒的构建，可通过一步或多步常规PCR扩增得到一段含有一个或多个待选mtDNA靶向目标序列和其它序列片段(或片段组合)的串联序列，将其连入克隆载体质粒中，若该载体有荧光标签，可同时与其中的荧光标签(EGFP、RFP等)编码序列融合，经测序验证，得正确的重组克隆质粒。优选地，该克隆载体质粒可为哺乳动物细胞表达载体pEGFP-N1，购自Clontech公司，含neo抗性基因和EGFP标签，可在多克隆位点(MCS)处插入外源基因并于EGFP融合，由CMV启动子启动，由于含有荧光标签可通过荧光显微镜观察绿色荧光情况，检测融合蛋白的表达情况。所述以pEGFP-N1克隆载体质粒为例，将一段含有两个mtDNA靶向目标序列T1、T2的序列连入其中的重组克隆质粒构建流程如图1A所示：1、以HEK293基因组DNA为模板，经CL-F1/CL-R1、CL-F2/CL-R2、CL-F3/CL-R3三对引物依次扩增得一段同时含有T1、T2靶向目标序列的mtDNA序列；2、将上述序列由NheI/AgeI两位点，经双酶切连入，经测序得正确质粒；3、以上述步骤所得正确质粒为模板，经CL-F4/CL-R4引物对扩增去除EGFP编码序列前的起始密码子ATG，由AgeI/NotI经双酶切连入，通过测序得到含mtDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选线粒体基因组编辑工具靶向目标序列的方法，其特征在于，构建一个核基因组中含有线粒体DNA(mtDNA)序列片段或片段组合的转基因细胞系，利用相应基因组编辑技术检测mtDNA靶向目标序列剪切活性，以筛选合适mtDNA靶向目标序列。

【技术特征摘要】
1.一种筛选线粒体基因组编辑工具靶向目标序列的方法，其特征在于，构建一个核基因组中含有线粒体DNA(mtDNA)序列片段或片段组合的转基因细胞系，利用相应基因组编辑技术检测mtDNA靶向目标序列剪切活性，以筛选合适mtDNA靶向目标序列。2.如权利要求1所述一种筛选线粒体基因组编辑工具靶向目标序列的方法，其特征在于适用范围广，基于ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因组编辑技术改造而成的线粒体基因组编辑工具，或其它线粒体基因组编辑工具，均可使用此方法筛选合适靶向目标序列。3.如权利要求1、2所述一种筛选线粒体基因组编辑工具靶向目标序列的方法，其特征在于，转基因细胞系中的mtDNA靶向目标序列剪切活性，可通过相应基因组编辑技术靶向剪切活性的鉴定方法进行检测。4.如权利要求1～3所述mtDNA靶向目标序列剪切活性的检测，其特征在于，可将含有相应mtDNA靶向目标序列的基因组编辑技术作用质粒转染到所构建的转基因细胞系中，经合适作用时间，利用相应基因组编辑技术靶向剪切活性的鉴定方法进行检测。5.如权利要求1～4所述利用相应基因组编辑技术靶向剪切活性的鉴定方法进行检测，其特征在于，可利用相应基因组编辑技术靶向剪切该细胞株的核基因组，通过...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂凌云，魏迪，池振奋，程东庆，
申请(专利权)人：聂凌云，
类型：发明
国别省市：北京;11