一种利用级联放大效应高敏监测水体PAHs的转荧光蛋白基因斑马鱼的研制方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种利用级联放大效应高敏监测水体PAHs污染物的转荧光蛋白基因斑马鱼的研制方法。所述方法以UAS‑Gal4基因表达调控系统为基础，利用优化重组的多环芳香烃响应元件AhREs驱动上游质粒Gal4的表达，进而对下游UAS质粒中荧光基因eGFP表达进行调控；同时创新性结合TALE‑TF转录激活增强技术，通过TALE转录激活效应进一步增强eGFP基因的表达量，达到多重增加荧光信号的目的；最终利用I‑SceI大范围核酸酶转移系统，可以获得稳定遗传的低拷贝诱导性转荧光蛋白基因斑马鱼，对斑马鱼毒性影响较小。通过制作对环境污染物高敏的转荧光蛋白基因斑马鱼，实现对水体中有毒污染物的简单、高效、灵敏、直观的监测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用级联放大效应高敏监测水体PAHs污染物的转荧光蛋白基因斑马鱼的研制方法。
技术介绍
现阶段环境污染尤其是水污染在世界各地普遍存在。水质的污染不仅会影响水生生物的生存与繁殖，而且污染物会通过生物富集浓缩作用到达食物链的终端，严重影响人类健康。近年来，人们在环境中频繁地检测出多环芳烃等有机污染物，研究表明这类污染物已对水环境、土壤及沉积物中生物的生存造成了严重威胁。其中环境水体中的有机污染物以芳香烃类污染物为主。传统检测芳香烃类污染物毒性效应的方法一般分为体外测试(Invitrotest)和体内测试(Invivotest)。但是体外测试不能体现对整个生物体的影响，体内测试又具有操作繁琐、实验昂贵且对低浓度暴露的反应不稳定等问题，因此，目前研究中较倾向于利用组合分层式检测方法(Tieredtest)测试芳香烃类污染物的毒性效应。但是该方法仍耗时、耗力且需要专业技术人员完成，而且不能用于现场直观监测。斑马鱼以其独特性可作为理想的环境监测模式生物。现阶段，已有部分国家使用野生型斑马鱼对水体环境进行监测，转基因鱼监测该类污染物的技术也随之产生。2001年Mattingly等首次证实斑马鱼的转录因子可以识别人的AhREs，在TCDD的诱导下可驱动GFP的表达，但是他们仅研究了芳香烃受体及其下游基因的功能，并没有将其应用于活体监测芳香烃类污染物。Payne观察到在石油污染的海水中，可诱导青鲈的CYP1A1活性出现变化，并通过检测苯并芘羟化酶的活性诱导效果监控海上的石油污染。此后，Nebert等利用包含AhREs的启动子驱动LUC报告基因的表达，研制出转基因斑马鱼来检测水体中芳香烃族有机污染物,但他们研制的转基因斑马鱼中LUC报告基因不能传至F2代。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种利用级联放大效应高敏监测水体PAHs污染物的转荧光蛋白基因斑马鱼的研制方法。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种监测水体环境污染物的转荧光蛋白基因鱼的培养方法，包括步骤：(1)提供水体环境污染物响应载体，所述水体环境污染物响应载体带有I-SceI大范围核酸酶转移系统，所述水体环境污染物响应载体包括：水体环境污染物响应元件、转录激活Gal4蛋白的基因序列、UAS序列和荧光蛋白序列；(2)提供荧光信号放大载体，包括步骤：在步骤(1)所述水体环境污染物响应载体的荧光蛋白序列之后克隆入转录激活因子TALE-VP64编码序列，获得荧光信号放大载体；(3)将水体环境污染物响应载体和荧光信号放大载体与I-SceI酶共同注射入鱼的受精卵，培养，获得监测水体环境污染物的转荧光蛋白基因鱼。优选地，所述鱼为斑马鱼，但是在其他鱼类也可适用。优选地，所述水体环境污染物响应元件为多环芳香烃响应元件，本方法但同样也适用于雌激素反应元件EREs、金属反应原件MREs和亲电性响应元素EpREs等。所述多环芳香烃响应元件含有如SEQIDNO.16所示的序列。优选地，所述荧光蛋白为eGFP，但同样也适用其他荧光蛋白如RFP、CFP、YFP和mCherry等。本专利技术一优选实施例中，所述水体环境污染物响应载体为多环芳香烃响应载体pI-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP，所述多环芳香烃响应载体含有如SEQIDNO.14所示的序列。优选地，所述转录激活因子TALE-VP64含有如SEQIDNO.17所示的序列。在本专利技术一优选实施例中，所述荧光信号放大载体为pI-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP-TALE-TF，所述荧光信号放大载体含有如SEQIDNO.15所所示的序列。优选地，所述培养还包括纯系转荧光蛋白基因鱼的筛选，包括步骤：将注射后的转荧光蛋白基因鱼P0培育至性成熟，然后与野生型鱼杂交，收集鱼卵，TCDD暴露，筛选出可表达荧光蛋白的转荧光蛋白基因鱼F1代；将所述转荧光蛋白基因鱼F1代再与野生型斑马鱼进行杂交，收集鱼卵，TCDD暴露，筛选出可表达荧光蛋白的转荧光蛋白基因鱼杂合体F2代；然后将杂合体F2代雌雄鱼进行自交，筛选出其中转荧光蛋白基因鱼F3代中的纯合体，即为纯系转荧光蛋白基因鱼。进一步优选地，筛选转荧光蛋白基因鱼F3代中的纯合体，包括步骤：将转荧光蛋白基因鱼F3代继续与野生型鱼杂交，如果后代胚胎发绿色荧光比例为100％，则F4代的亲本F3为纯系转荧光蛋白基因鱼。本专利技术的第二方面，提供了一种由前述方法培养获得的转荧光蛋白基因鱼。优选地，所述转荧光蛋白基因鱼为转荧光蛋白基因斑马鱼。所述转荧光蛋白基因鱼能够稳定遗传且具有荧光强度放大功能，能够高敏监测水环境污染物。本专利技术的第三方面，提供了前述转荧光蛋白基因鱼用于检测水环境污染物的用途。本专利技术的第四方面，提供一种载体组合，包括：水体环境污染物响应载体和荧光信号放大载体，所述水体环境污染物响应载体带有I-SceI大范围核酸酶转移系统，所述水体环境污染物响应载体包括：水体环境污染物响应元件、转录激活Gal4蛋白的基因序列、UAS序列和荧光蛋白序列；所述荧光信号载体为在所述水体环境污染物响应载体的荧光蛋白序列之后克隆入转录激活因子TALE-VP64编码序列获得。本专利技术的第五方面，提供了前述载体组合用于培养转荧光蛋白基因鱼的用途。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术公开了一种对水体持久性有机污染物多环芳烃(PAHs)高度敏感的转荧光蛋白基因斑马鱼的制备方法。针对目前已有环境监测转荧光蛋白基因斑马鱼存在可监测浓度较低、荧光强度不足的缺陷，本专利技术提供了一种荧光信号放大系统，研制出对水体中多环芳烃类(PAHs)有机污染物具有更高敏感度的监测斑马鱼。本专利技术主要是利用UAS-Gal4基因表达调控系统为基础，用优化重组的多环芳香烃响应元件AhREs替换上游质粒Gal4中的启动子，达到响应水体环境中多环芳香烃，产生的Gal4蛋白结合下游质粒中UAS序列，达到激活荧光蛋白基因eGFP的目的，此为一个2级信号放大系统。同时，我们利用TALE-TF转录激活增强技术，进一步对eGFP基因的转录进行增强，最终达到多重信号放大效应。在利用I-SceI大范围核酸酶转移系统，获得2个品系的转基因斑马鱼后，通过不断筛选最终获得能够稳定遗传且具有荧光强度放大功能的高敏型多环芳香烃类污染物监测荧光斑马鱼。附图说明图1：本专利技术构建的pI-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP载体示意图。图2：本专利技术构建的pI-SceI/3*AhREs-Gal4/UAS-eGFP-TALE-TF荧光信号放大载体示意图。图3：经筛选所得F3代纯合子，通过不同浓度梯度TCDD诱导荧光表达的试验结果。图4：通过TALE-TF放大的转荧光蛋白基因鱼在TCDD暴露下荧光强度的结果图。具体实施方式在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种监测水体环境污染物的转荧光蛋白基因鱼的培养方法，包括步骤：(1)提供水体环境污染物响应载体，所述水体环境污染物响应载体带有I‑SceI大范围核酸酶转移系统，所述水体环境污染物响应载体包括：水体环境污染物响应元件、转录激活Gal4蛋白的基因序列、UAS序列和荧光蛋白序列；(2)提供荧光信号放大载体，包括步骤：在步骤(1)所述水体环境污染物响应载体的荧光蛋白序列之后克隆入转录激活因子TALE‑VP64编码序列，获得荧光信号放大载体；(3)将水体环境污染物响应载体和荧光信号放大载体与I‑SceI酶共同注射入鱼的受精卵，培养，获得监测水体环境污染物的转荧光蛋白基因鱼。

【技术特征摘要】
1.一种监测水体环境污染物的转荧光蛋白基因鱼的培养方法，包括步骤：(1)提供水体环境污染物响应载体，所述水体环境污染物响应载体带有I-SceI大范围核酸酶转移系统，所述水体环境污染物响应载体包括：水体环境污染物响应元件、转录激活Gal4蛋白的基因序列、UAS序列和荧光蛋白序列；(2)提供荧光信号放大载体，包括步骤：在步骤(1)所述水体环境污染物响应载体的荧光蛋白序列之后克隆入转录激活因子TALE-VP64编码序列，获得荧光信号放大载体；(3)将水体环境污染物响应载体和荧光信号放大载体与I-SceI酶共同注射入鱼的受精卵，培养，获得监测水体环境污染物的转荧光蛋白基因鱼。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鱼选自但不限于斑马鱼。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还含有以下特征的任一项或多项：1)所述水体环境污染物响应元件选自多环芳香烃响应元件AhREs、雌激素反应元件EREs、金属反应原件MREs或亲电性响应元素EpREs，所述多环芳香烃响应元件含有如SEQIDNO.16所示的序列；2)所述荧光蛋白选自eGFP、RFP、CFP、YFP或mCherry；3)所述转录激活因子TALE-VP64含有如SEQIDNO.17所示的序列。4.根据权利要1所述的方法，其特征在于，所述水体环境污染物响应载体含有如SEQIDNO.14所示的序列。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴得胜，贺超，谢少林，马彦博，
申请(专利权)人：中国科学院重庆绿色智能技术研究院，
类型：发明
国别省市：重庆;50