卵母细胞表达mCherry蛋白斑马鱼家系构建方法，涉及斑马鱼。包括以下步骤：1)zpc启动子的克隆；2)pminiTol2‑zpc‑mCherry表达载体的构建；3)体外合成Tol2转座酶加帽mRNA；4)mCherry转基因斑马鱼家系的建立。首先采用PCR的方法，从斑马鱼基因组中得到了zpc基因的启动区序列，再利用pminiTol2‑Mlc2f‑mCherry载体，进而构建pminiTol2‑zpc‑mCherry转基因表达载体，最后通过对斑马鱼胚胎进行显微注射的方法，构建了一个卵母细胞特异表达mCherry荧光蛋白的转基因斑马鱼家系。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及斑马鱼，尤其是涉及卵母细胞表达mCherry蛋白斑马鱼家系构建方法。
技术介绍
斑马鱼具有易于养殖、体外受精、胚胎透明、生活史短等优点，是研究脊椎动物早期发育的模型动物。在基础科学研究中，利用转基因技术，让荧光蛋白特异地表达在组织器官中，已成为一种重要的研究手段。很多实验中，用使用荧光蛋白来标记在不同性别斑马鱼中差异表达的基因的方法来研究斑马鱼的生殖生物学的方法已经被广泛使用。本专利技术应用了Tol2转座子体系，来构建卵母细胞特异表达mCherry荧光蛋白的斑马鱼家系，以期为斑马鱼生殖生物学的研究提供实用的工具。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供卵母细胞表达mCherry蛋白斑马鱼家系构建方法。本专利技术包括以下步骤：1)zpc启动子的克隆，具体方法如下：取20mg新鲜斑马鱼肌肉，按海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的方法提取基因组DNA；根据NCBI上已报道的斑马鱼zpc启动子基因序列，设计一对引入酶切位点的特异引物：Zpc0.5：RFP-fw2：5’-GTGGCTAAGCAAAATCCCCATGACATGCTGC-3’(下划线部分为BlpI酶切位点)；Zpc0.5：RFP-rv1：5’-GCGGGATCCATTGCCTGCTGACTAATTAAACC-3’(下划线部分为BamHI酶切位点)；以斑马鱼基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增片段经切胶回收后进行TA克隆连入pMD19T(Simple)质粒，氨苄青霉素筛选，得到pMD19T-zpc单克隆，摇菌，提取质粒，测序鉴定；在步骤1)中，所述PCR扩增的反应条件可为：94℃预变性3min，每个循环包括94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸1min，共34个循环，最后1个循环结束后再72℃延伸10min。2)pminiTol2-zpc-mCherry表达载体的构建，具体方法如下：用限制性内切酶BlpI/BamHI双酶切pMD19T-zpc，切胶回收带有酶切位点的zpc启动子片段；用限制性内切酶HindIII/BamHI双酶切pminiTol2-Mlc2f-mCherry质粒，切胶回收pminiTol2-mCherry骨架，再将zpc启动子片段连接到pminiTol2-mCherry骨架、测序鉴定得到pminiTol2-zpc-mCherry质粒；3)体外合成Tol2转座酶加帽mRNA，具体方法如下：用限制性内切酶BamHI酶切pT3TS-Tol2质粒，切胶回收得到线性片段，然后使用mMESSAGET3试剂盒进行体外转录得到Tol2转座酶加帽mRNA，Nanodrop2000测定浓度；4)mCherry转基因斑马鱼家系的建立，具体方法如下：产卵前一天性成熟雌雄鱼以1∶(1～2)比例配对，放在同一繁殖缸中并用隔板隔开，第二天08：00拿掉隔板进行配对产卵；收集发育到1～2细胞期的胚胎后，将含有质粒pminiTol2-zpc-mCherry和Tol2转座酶加帽mRNA的液体注射到受精卵中，注射后的受精卵放在E3培养液中培养；孵化后转至鱼房继续培养，在注射后于荧光显微镜下观察筛选具有mCherry荧光信号的胚胎个体，作为zpc-mCherry转基因鱼F0代进行孵化培养，F0代鱼性成熟后与野生型斑马鱼配对，从而筛选出可传代F1代杂合个体，并将其培养至性成熟后再进行同质配对，最终获得卵母细胞稳定表达mCherry荧光蛋白的转基因斑马鱼家系。在步骤4)中，所述质粒pminiTol2-zpc-mCherry可采用浓度为50ng/μL的质粒pminiTol2-zpc-mCherry；所述Tol2转座酶加帽mRNA可采用浓度为50ng/μL的Tol2转座酶加帽mRNA；所述质粒pminiTol2-zpc-mCherry和Tol2转座酶加帽mRNA的液体总体积可为2nL；所述E3培养液的组成可为：5mmol/LNaCl，0.17mmol/LKCl，0.33mmol/LCaCl2，0.33mmol/LMgSO4；所述培养可置于28℃恒温培养箱中培养；所述继续培养可孵化后转至28℃鱼房继续培养；所述于荧光显微镜下观察可在注射后28天左右于荧光显微镜下观察。本专利技术首先采用PCR的方法，从斑马鱼基因组中得到了zpc基因(ZonaPellucida，zpc)的启动区序列，再利用pminiTol2-Mlc2f-mCherry载体，进而构建pminiTol2-zpc-mCherry转基因表达载体。最后通过对斑马鱼胚胎进行显微注射的方法，构建了一个卵母细胞特异表达mCherry荧光蛋白的转基因斑马鱼家系。附图说明图1为pminiTol2-Mlc2f-mCherry表达载体的构建流程图。图2为各个时期的zpc-mCherry转基因斑马鱼家系。在图2中，A、B为28日龄雌性幼鱼腹部；C、D为3月龄成鱼卵巢组织。具体实施方式1.1材料1.1.1菌种与载体Escherichia.coliDH5α菌株购自Takara公司(货号9057)、pminiTol2-Mlc2f-mCherry质粒均来自本实验室，pMD19T(Simple)质粒购自Takara公司，Tol2转座子体系质粒pminiTol2、pT3TS-Tol2购自Addgene公司。1.1.2酶与化学试剂海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，限制性内切酶、T4连接酶购自NEB公司，mMESSAGET3(AM1348)试剂盒购自Ambion公司；1.1.3实验动物试验用斑马鱼属于Tuebingen家系，在本实验长年繁育。1.1.4主要仪器设备PCR仪(Mastercyclernexus，eppendorf公司)，离心机(Centrifuge5424，eppendorf公司)，荧光体式显微镜(M165FC，Leica公司)，气动皮升泵(PV830，WPI公司)，显微注射仪(M-152，Narishige公司)，立体解剖显微镜(S6D，Leica公司)，Nanodrop2000(Thermoscientific公司)。1.2方法1.2.1zpc启动子的克隆取20mg新鲜斑马鱼肌肉，按海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的方法提取基因组DNA；根据NCBI上已报道的斑马鱼zpc启动子基因序列，设计一对引入酶切位点的特异引物：Zpc0.5：RFP-fw2：5’-GTGGCTAAGCAAAATCCCCATGACATGCTGC-3’(下划线部分为BlpI酶切位点)；Zpc0.5：RFP-rv1：5’-GCGGGATCCATTGCCTGCTGACTAATTAAACC-3’(下划线部分为BamHI酶切位点)。以斑马鱼基因组DNA为模板，进行PCR扩增，反应条件如下：94℃预变性3min，每个循环包括94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸1min，共34个循环，最后1个循环结束后再72℃延伸10min。扩增片段经切胶回收后进行TA克隆连入pMD19T(Simple)质粒，氨苄青霉素筛选，得到pMD19T-zpc单克隆，摇菌，提取质粒，测序鉴定。1.2.2pminiTol2-zpc-mCherry表达载体的构建用限制性内切酶BlpI/BamHI双酶切pMD19T-zpc，切胶回收带有酶切位点的本文档来自技高网...
【技术保护点】
卵母细胞表达mCherry蛋白斑马鱼家系构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)zpc启动子的克隆，具体方法如下：取20mg新鲜斑马鱼肌肉，按海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的方法提取基因组DNA；根据NCBI上已报道的斑马鱼zpc启动子基因序列，设计一对引入酶切位点的特异引物：Zpc0.5:RFP‑fw2：5’‑GTGGCTAAGCAAAATCCCCATGACATGCTGC‑3’(下划线部分为BlpI酶切位点)；Zpc0.5:RFP‑rv1：5’‑GCGGGATCCATTGCCTGCTGACTAATTAAACC‑3’(下划线部分为BamHI酶切位点)；以斑马鱼基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增片段经切胶回收后进行TA克隆连入pMD19T(Simple)质粒，氨苄青霉素筛选，得到pMD19T‑zpc单克隆，摇菌，提取质粒，测序鉴定；2)pminiTol2‑zpc‑mCherry表达载体的构建，具体方法如下：用限制性内切酶BlpI/BamHI双酶切pMD19T‑zpc，切胶回收带有酶切位点的zpc启动子片段；用限制性内切酶HindIII/BamHI双酶切pminiTol2‑Mlc2f‑mCherry质粒，切胶回收pminiTol2‑mCherry骨架，再将zpc启动子片段连接到pminiTol2‑mCherry骨架、测序鉴定得到pminiTol2‑zpc‑mCherry质粒；3)体外合成Tol2转座酶加帽mRNA，具体方法如下：用限制性内切酶BamHI酶切pT3TS‑Tol2质粒，切胶回收得到线性片段，然后使用mMESSAGE试剂盒进行体外转录得到Tol2转座酶加帽mRNA，Nanodrop 2000测定浓度；4)mCherry转基因斑马鱼家系的建立，具体方法如下：产卵前一天性成熟雌雄鱼以1︰(1～2)比例配对，放在同一繁殖缸中并用隔板隔开，第二天08:00拿掉隔板进行配对产卵；收集发育到1～2细胞期的胚胎后，将含有质粒pminiTol2‑zpc‑mCherry和Tol2转座酶加帽mRNA的液体注射到受精卵中，注射后的受精卵放在E3培养液中培养；孵化后转至鱼房继续培养，在注射后于荧光显微镜下观察筛选具有mCherry荧光信号的胚胎个体，作为zpc‑mCherry转基因鱼F0代进行孵化培养，F0代鱼性成熟后与野生型斑马鱼配对，从而筛选出可传代F1代杂合个体，并将其培养至性成熟后再进行同质配对，最终获得卵母细胞稳定表达mCherry荧光蛋白的转基因斑马鱼家系。...
【技术特征摘要】
1.卵母细胞表达mCherry蛋白斑马鱼家系构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)zpc启动子的克隆，具体方法如下：取20mg新鲜斑马鱼肌肉，按海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的方法提取基因组DNA；根据NCBI上已报道的斑马鱼zpc启动子基因序列，设计一对引入酶切位点的特异引物：Zpc0.5:RFP-fw2：5’-GTGGCTAAGCAAAATCCCCATGACATGCTGC-3’(下划线部分为BlpI酶切位点)；Zpc0.5:RFP-rv1：5’-GCGGGATCCATTGCCTGCTGACTAATTAAACC-3’(下划线部分为BamHI酶切位点)；以斑马鱼基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增片段经切胶回收后进行TA克隆连入pMD19T(Simple)质粒，氨苄青霉素筛选，得到pMD19T-zpc单克隆，摇菌，提取质粒，测序鉴定；2)pminiTol2-zpc-mCherry表达载体的构建，具体方法如下：用限制性内切酶BlpI/BamHI双酶切pMD19T-zpc，切胶回收带有酶切位点的zpc启动子片段；用限制性内切酶HindIII/BamHI双酶切pminiTol2-Mlc2f-mCherry质粒，切胶回收pminiTol2-mCherry骨架，再将zpc启动子片段连接到pminiTol2-mCherry骨架、测序鉴定得到pminiTol2-zpc-mCherry质粒；3)体外合成Tol2转座酶加帽mRNA，具体方法如下：用限制性内切酶BamHI酶切pT3TS-Tol2质粒，切胶回收得到线性片段，然后使用mMESSAGE试剂盒进行体外转录得到Tol2转座酶加帽mRNA，Nanodrop2000测定浓度；4)mCherry转基因斑马鱼家系的建立，具体方法如下：产卵前一天性成熟雌雄鱼以1︰(1～2)比例配对，放在同一繁殖缸中并用隔板隔开，第二天08:00拿掉隔板进行配对产卵；收集发育到1～2细胞期的胚胎后，将含有质粒pminiTol2-zpc-mCherry和Tol2转座酶加帽m...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈仕玺，黄晶，薛享宁，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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