【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，涉及一种人工重组的五联体蛋白A以及其 构建方法与用途。
技术介绍
蛋白A的发现从一开始就与IgG (免疫球蛋白G)相关联，早在1940年， Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种在双向扩散试验中能与正常人 血清形成沉淀的物质。Jensen ( 1959)也发现类似现象，并将其命名为A抗原。 直到1963年Lofkvist等分离了该抗原，并证明它是一种蛋白质。为与糖相区别， Grov ( 1960)将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称SPA或蛋白A。 1978年，有研 究者将加热灭活并经福尔马林固定的金黄色葡萄球菌用于一种癌症的治疗，显 示出一定的疗效，这是世界上第一次利用蛋白A的抗体吸附性治疗相关疾病的 报道。Uhlen等在1984年阐明了蛋白A的全基因序列和相应的氨基酸序列。2003 年L.Yang等应用表面张力探针证明每个蛋白A分子可结合两个IgG分子。SPA 基因的核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列已有报道(Uhl6n M, Guss B, Nilsson B, Gatenbeck S, Philipson L, Lindberg M. Complete sequence of the staphylococcal gene encoding protein A. A gene evolved through multiple duplications. J Biol Chem. 1984 Feb 10;259(3):1695-702.)。蛋白A的基因编码序列由1464个碱基组成(若加上氨基端信号肽序列则 为1...
【技术保护点】
一种人工重组的五联体蛋白Ａ，其特征在于：具有如序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所述的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1所述的人工重组的五联体蛋白A的基因。本发明所述的基因，具有如序列表中SEQIDN0.2所述的核苷酸序列。 本发明还提供了包含如权利要求3所述的基因的重组表达载体。 本发明还提供了用如权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的 转化体。本发明所述的转化体，宿主细胞为大肠杆菌。本发明还提供了所述的人工重组的五联体蛋白A的基因的构建方法，包括 以下步骤设计并合成三个单链DNA片段，其核苷酸序列分别为SEQ IDN0.3、 SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5;将这三个片段互为引物和模板，通过聚合酶链 反应获得所述重组蛋白A基因的结构单体；经酶切、连接而得到由5个所述结 构单体组成的重组蛋白A基因。本发明还提供了如权利要求1所述的人工重组的五联体蛋白A的制备方 法，包括以下步骤培养本发明所述的转化体，诱导表达重组蛋白A，再经硫 酸铵沉淀和镍离子螯合层析纯化得到重组蛋白A。本发明还提供了所述的人工重组的五联体蛋白A用于人血浆中抗体的吸附 和清除的用途。本发明还提供了一种免疫吸附填料，其含有本发明所述的人工重组的五联体蛋白A;以及琼脂糖凝胶载体。本发明所述的人工重组的五联体蛋白A，具有以下特点与优点本发明所述的重组蛋白A基因主要是由5个基因单体构成，该基因单体的 碱基序列的设计来源于天然蛋白A的B结构域的编码序列。其中，第一个结构单体的氨基酸序列与B结构域完全相同；第二个结构单体的第一个氨基酸由丙6氨酸突变成缬氨酸(与B结构域相比)，第三、四、五个结构单体的第一个氨 基酸均由丙氨酸突变成亮氨酸(与B结构域相比)。并且，重组蛋白A的羧基 末端有8个组氨酸组成的标签，以便于该蛋白质的纯化。由于天然蛋白A分子中的E、 D、 A、 B、 C这五个结构域均具备结合IgG 的能力，并且从己经公开的天然蛋白A的氨基酸序列可以看出，这五个结构域 的氨基酸序列具有相当高的同源性，如A、 C结构域与B结构域分别具有89。/。 和91%的同源性。其中，B结构域所包含的同源性序列比例最高，由此可以推 测，在E、 D、 A、 B、 C这五个结构域中，B结构域具有最强的IgG结合能力。 本发明采用了五个基于B结构域的单体进行串联，以获得具有更高IgG吸附活 性的重组蛋白A，希望接近甚至超过天然蛋白A的活性。前述的在先申请中披 露的重组蛋白A均由三个结构单体串联而成，撇开各自的氨基酸序列设计差异 的不同，仅从单体串连的数目看，本发明所述的蛋白A的潜在活性已经优于已 报道的重组蛋白A。在后面的实验中，本发明的技术效果得到了证实(具体见 实施例5和实施例6)。在本发明的一个实施例中，所述的重组蛋白A基因(命名为spa-b5)由5 个重组蛋白A基因单体(命名为spa-b)串联而成，每个基因单体由人工合成 的3个单链DNA引物片段(分别命名为B1,B2， B3)经PCR反应拼接而成。5 个基因单体中，前2个通过Sail的酶切位点相连，其余通过Sail和Xhol (同 尾酶)的酶切位点相连。其中第一个重组蛋白A基因单体的5'端加入序列 GGGCCATGGGT，包括与表达载体pQE—TriSystemHisStrepl相连的Ncol酶切 位点，最后一个重组蛋白A基因单体的3'端加入序列CTCGAGCCC，包括与 表达载体pQE—TriSystemHisStrepl相连的Xhol酶切位点。这里所采用的表达载体是pQE—TriSystemHisStrep 1 ，该载体是德国Qiagen公司的商品化的pQE系列载体的一种，pQE系列载体属于pDS载体家族成员(Bujard, H.， Gentz, R., Lanzer, M., Stiiber, D. Miiller, M.， Ibrahimi, I.股uptle, M.T.， and Dobberstein, B. (1987)AT5 promotor based transcription-translation system for the analysis of proteins in vivo and in vitro.Methods Enzymol. 155, 416—433.)， 在载体 pDS56/RBSII和pDS781/RBSII-DHFRS的基础上构建而成(Stiiber， D., Matile, H.,and Garotta, G (1990) System for high-level production in Escherichia coli and rapid purification of recombinant proteins: application to epitope mapping, preparation of antibodies, and structure-function analysis. In: Immunological Methods, Lefkovits, I. and Pernis, B., eds.， vol. IV,Academic Press, New York, pp. 121-152.)，其载体图谱 禾口序歹U详见http:〃wwwl .qiagen.com/literature/vectors_pqe.aspx。本发明也可采用其他表达载体，只需相应地调整与表达载体相连的酶切位点 即可。经测序，该基因由906个脱氧核苷酸组成，编码302个氨基酸。该基因序 列见序列表SEQIDN0.2，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.l。附图说明图1是重组蛋白A基因表达产物及其分离纯化的SDS-PAGE电泳图。图中， 泳道l为细菌总蛋白，泳道2为超声破碎细胞的沉淀组分，泳道3为超声破碎 细胞的上清组分，泳道4为低分子量蛋白标准，泳道5为穿流的蛋白组分，泳 道6为含20mmol/L咪唑的洗脱液组分，泳道7为含100mmol/L咪唑的洗脱液 组分，泳道8为含200mmol/L咪唑的洗脱液组分。图2是重组蛋白A与现有重组或天然蛋白A的活性测定结果图。图3为血浆吸附图谱。图4为血浆吸附的SDS-GAGE电泳分析结果，图中，泳道1是低分子量蛋 白标准，泳道2是洗脱液成分，上下两条带分别是抗体的重链和轻链。具体实施方式以下通过实施例结合附图对本发明作进一步的详细说明，这并不限制本发 明的保护范围。实施例一重组蛋白A基因单体的获取设计三条单链DNA引物，其核苷酸序列分别为SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5 (见序列表)，交由专业公司合成，通过PCR反应进行拼接获 得重组蛋白A基因单体，在该单体5'端含有BamHI酶切位点，3'端含有HindIII 酶切位点，再通过酶切连接将该基因单体连接入载体pQE—TriSystemHisStrepl 中，获得含重组蛋白A基因单体的重组载体pQE-spa-b。实施例二重组蛋白A基因的获取及含重组蛋白A基因的表达载体的构建 设计第一对引物CL1: 5'-gggCCATGGGTGcggataacaaattcaacaaag-3， CL2: 5 ，-cccGTCGACttttggtgcttgCgcatc-3'设计第二对引物CL3: 5'-cccGTCGACaacaaattcaacaaagaac-3' CL4: 5'- gggCTCGAGttttggtgcttgCgc -3'用这两对引物分别扩增基因单体，扩增产物CL1-2的5'端和3'端分别具有 Ncol和Sail的识别位点，CL3-4的5'端和3'端分别具有Sail和Xhol的识别位 点。CLl-2和CL3-4经Sall酶切后进行连接，获得2个基因单体串联而成的重 组蛋白A基因，命名为spa-b2。 spa-b2经Ncol和Xhol酶切并与载体 pQE一TriSystemffisStrepl连接，获得包含2个基因单体串联而成的重组蛋白A 基因的重组载体pQE-spa-b2。经Sail和Xhol酶切的CL3-4和经Xhol酶切的载 体pQE-spa-b2连接，获得包含3个基因单体串联而成的重组蛋白A基因的重 组载体pQE-spa-b3。以此类推，可依次获得含4个基因单体串联而成的重组蛋 白A基因的重组载体pQE-spa-b4和含5个基因单体串联而成的重组蛋白A基 因的重组载体pQE-spa-b5。上述含spa-b5的大肠杆菌表达载体由本发明制备的重组蛋白A基因 (spa-b5)与大肠杆菌表达载体PQE_TriSystemHisStrepl构建而成，命名为 pQE-spa-b5 。实施例三能高效表达重组蛋白A的大肠杆菌重组株pQE-spa-b5-BL21 (DE3)的构建将重组载体pQE-spa-b5转化大肠杆菌BL21 (DE3),按常规方法筛选具有氨苄青霉素抗性的重组菌株pQE-spa-b5-BL21 (DE3)。实施例四利用大肠杆菌重组株pQE-spa-b5-BL21(DE3)生产重组蛋白A1) 将甘油保种的工程菌株pQE-spa-b5-BL21(DE3)按体积比1: 100接入 3mLLB培养基(Amp,100pg/mL)， 37°C振摇12h。2) 上述培养液按l: 100接入100mL LB培养基(Amp,100叫/mL)， 37°C 振摇12h以进一步扩大培养。3) 上述培养液按1: 25接入2L加富培养基(Amp,100pg/mL)， 37°C振 摇3.5h至OD600=1.5。4) 加入IPTG至终浓度为O.5mmol/L， 37°C继续振摇5h。5) lOOOOg、 10min离心收集细菌沉淀，细菌沉淀可放置于-20。C一-80°C冰 箱保存备用。6) 将上述细菌沉淀的重新混匀于lOOmLPBS溶液中，超声破碎细胞(相 关参数为超声时间4s，间隔时间4s，功率200W，总时间100min)。7) lOOOOg， 15min离心，收集上清。8) 在缓慢搅拌的同时将硫酸铵固体粉末缓慢加入上清溶液至饱和度为 70%， ^C放置lh， 10000g， 15min离心收集沉淀并重新溶于PBS溶液。9) 取Ni NTAAgarose(Qiagen公司生产)约7.5mL填装柱子，先后用5 10 个柱床体积的双蒸水和PBS冲洗填料并平衡，将蛋白样品流经填料以吸附目标 蛋白。10) 先以含20 mmol/L咪唑的PBS冲洗填料至OD280不再下降，用含100 mmol/L咪唑的PBS洗脱目标蛋白并收集，最后再用含200 mmol/L咪唑的PBS洗脱一遍。11) 含100 mmol/L咪唑的PBS洗脱液经硫酸铵沉淀后可获得纯度在90% 以上的SPA-B5蛋白。重组蛋白A基因表达产物的鉴定SDS-PAGE法，电泳图见图1。本发明 的重组蛋白A在该菌株中以可溶形式表达，约占细菌总蛋白的30~40%，经纯 化后蛋白纯度达到90%以上。实施例五重组蛋白A与现有重组或天然蛋白A的活性测定101) 分别将本发明的重组蛋白A(SPA-B5)、本元正阳基因技术有限公司生 产的重组蛋白A (国产SPA)和美国Sigma公司生产的天然蛋白A (进口 SPA) 用包被液(0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH9.6)配成浓度依次为100ng/mL， 50ng/mL， 25ng/mL， 12.5ng/mL， 6.25ng/mL， 3.125ng/mL的溶液。2) 各取上述溶液lOO^L加入96孔板，阴性对照以包被液代替样品，空白 对照除底物外，其余反应成分均不加入，每个浓度做2个重复。置于37GClh。3) 甩掉板孔中溶液，每孔加入洗涤液(含0.02。/。Tween-20的PBS...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈校园，余波光，彭涛，张旭锋，
申请(专利权)人：广州康盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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