重组双功能融合蛋白及其制法和用途制造技术

本发明专利技术涉及重组双功能融合蛋白及其制法和用途。具体地，本发明专利技术公开了一种融合蛋白，具有包括TGF‑β受体膜外区的元件A、VEGFR1第二膜外区D2的元件B和免疫球蛋白元件C，三者串联在一起。该蛋白可以同时与VEGF和TGF‑β1两种配体结合，并具有较好的结合活性，从而抑制配体的生物学活性。本发明专利技术还提供了重组双功能融合蛋白在疾病治疗中的作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域。更具体地，本专利技术涉及一种新型重组双功能融合蛋白 及其制法和用途。
技术介绍
肿瘤、肝纤维化等疾病每年夺走几千万人的生命，造成数亿美元的经济损失。细胞 膜表面的TGF-β和VEGFR受体和相应配体的结合，是此类疾病产生和发展的一类重要原 因，因此开发相应的蛋白配体药物具有良好的应用前景。 目前公知的蛋白药包括生长因子、激素类蛋白、酶类蛋白、细胞因子、干扰素、促红 细胞生成素、以及融合蛋白等。除融合蛋白以外，其它蛋白药均属于均质蛋白，即只含有一 种蛋白成分。而现有的融合蛋白药（如阿瓦斯汀Avastin、阿柏西普Aflibercept)由受体 蛋白的膜外区与人IgG Fc段融合而成，虽然含有两种或两种以上蛋白成分，但仍然只发挥 一种功能，即只能阻断一种细胞膜内源性受体与相应配体的结合。 虽然基因重组双功能融合蛋白已有报道，但其组成及所对应的靶点各异。迄今为 止可以同时与TGF-βΙ及VEGF结合、并同时阻断这两个靶点所诱导的生物学活性的双功能 融合蛋白药物未有报道。因此，开发此类新型双功能融合蛋白药物对延长患者的生存时间、 改善患者的生存质量、降低死亡率具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型重组双功能融合蛋白及其制法和用途。 本专利技术的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括融合在一起的以下 元件： (i)任选的位于N端的信号肽； (ii)第一蛋白元件； (iii)第二蛋白元件；以及 (iv)与第一蛋白元件和/或第二蛋白元件连接的免疫球蛋白元件， 其中，所述信号肽可操作地连于由（ii)、（iii)和（iv)所构成的融合元件； 并且第一蛋白元件为TGF-β受体膜外区蛋白元件；第二蛋白元件为包括血管内 皮细胞生长因子受体VEGFRl第二膜外区D2的蛋白元件。 在另一优选例中，所述的"可操作地连于"指所述信号肽可引导所述融合元件的表 达或跨膜转移（定位）。 在另一优选例中，所述的融合蛋白具有选自下组的结构： (1)式Ia或式Ib所述结构： D-A-B-C (Ia)，或 D-B-A-C (Ib) (2)式II a或式II b所述结构： D-A-C-B (Ila)，或 D-B-C-A ( II b) 其中， A为TGF-β受体膜外区蛋白元件； B为包括血管内皮细胞生长因子受体VEGFRl第二膜外区D2的蛋白元件； C为免疫球蛋白元件； D为任选的信号肽序列； " "表示连接上述元件的肽键或肽接头。 在另一优选例中，所述元件A选自下组：T β RI、T β RII、T β RIII。 在另一优选例中，所述元件A为Τβ RII膜外区的蛋白元件。 在另一优选例中，所述元件A具有SEQ ID NO. :1中第24-184位所示的氨基酸序 列。 在另一优选例中，所述元件B具有SEQ ID NO. : 1中第190-282位所示的氨基酸序 列（核心序列）并且长度为94、95、96、97、98、99、或100个氨基酸。 在另一优选例中，所述元件B中位于SEQ ID NO. : 1中第190-282位所示的氨基酸 序列（核心序列）两侧的氨基酸序列分别来自于天然VEGFRl的第二膜外区D2(D〇main2，） 两侧氨基酸序列。 在另一优选例中，所述D2具有侧翼序列，所述侧翼序列包括： 位于D2氨基端的第一侧翼序列；和/或位于D2羧基端的第二侧翼序列。 在另一优选例中，所述第一侧翼序列由1-5个氨基酸残基组成。 在另一优选例中，所述第二侧翼序列由1-2个氨基酸残基组成。 在另一优选例中，所述的第一和第二侧翼序列分别来自天然VEGFRl的第二膜外 区D2(SEQ ID NO. : 1中第190-282位）两侧氨基酸序列。 在另一优选例中，所述第一侧翼序列为SDTGR。 在另一优选例中，所述第二侧翼序列为NT。 在另一优选例中，所述元件C为人免疫球蛋白IgGl的Fe片段。 在另一优选例中，所述的肽接头的长度为0-10氨基酸，较佳地为0-5个氨基酸。 在另一优选例中，所述融合蛋白还包括信号肽元件D。 在另一优选例中，所述信号肽元件D的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1中第1-23位所 /Jn 〇 在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 在另一优选例中，所述融合蛋白不含信号肽，并且结构式选自下组： (1)式la'或式lb'所述结构： A-B-C (la，），或 B-A-C (lb，） (2)式II a'或式II b'所述结构： A-C-B ( II a，），或 B-C-A ( II b') 式中，A、B、C和的定义如上所述。 在另一优选例中，所述融合蛋白具有以下多种功能： a)与 VEGF 的结合活性 EC5tl 为 0· 6-2nM ; b)与 TGF- β 1 的结合活性 EC5。为 L 5-2. 5nM ; c)可以同时与VEGF和TGF- β 1两种配体结合； d)可阻断VEGF诱导的体外或体内血管形成； e)可抑制TGF-β 1所诱导的肿瘤细胞的迁移和侵袭。 本专利技术的第二方面，提供了一种蛋白二聚体，所述的二聚体由两个根据本专利技术第 一方面的任一所述的融合蛋白构成。 在另一优选例中，所述二聚体具有选自下组的结构： (1)式Ia-I或式Ib-I所述结构： (2)式II a-Ι或式II b-Ι所述结构： 其中， A为TGF- β受体膜外区蛋白元件； B为包括VEGFR第二膜外区D2的蛋白元件； C为免疫球蛋白元件； D为任选的信号肽序列； 表示连接上述元件的肽键或肽接头； " II"表示二硫键。 在另一优选例中，所述融合蛋白不含信号肽，并且具有选自下组的结构： (1)式Ia-Ι'或式Ib-Ι'所述结构： (2)式II a-Γ或式II b-Γ所述结构： 式中，A、B、C、"_"和" Il "的定义如上所述。 本专利技术的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码根据本发 明第一方面的所述的融合蛋白。 本专利技术的第四方面，提供了一种载体，它含有本专利技术第三方面所述的多核苷酸。 本专利技术的第五方面，提供了一种宿主细胞，它含有本专利技术第四方面所述的载体或 基因组中整合有本专利技术第三方面所述的所述的多核苷酸。 在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞（如CHO细胞、NSO细胞、 293细胞）。 本专利技术的第六方面，提供了一种产生蛋白的方法，它包括步骤： (1)在适合表达的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞，从而表达出权利要求 1所述的融合蛋白；和 (2)分离所述融合蛋白或由所述融合蛋白形成的二聚体。 本专利技术的第七方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含： 根据本专利技术第一方面所述的融合蛋白和/或根据本专利技术第二方面所述的蛋白二 聚体，以及 药学上可接受的载体。 本专利技术的第八方面，提供了根据本专利技术第一方面所述的融合蛋白和/或根据本发 明第二方面所述的蛋白二聚体的用途，用于制备治疗疾病的药物。 在另一优选例中，所述的疾病为与TGF-β及VEGF相关的疾病。 在另一优选例中，所述的疾病选自：肿瘤、肝脏纤维化。 在另一优选例中，所述肿瘤包括：大肠癌肿瘤、肺癌肿瘤、肝癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、 胃癌肿瘤、胰腺癌肿瘤。 本专利技术的第九方面，提供了一种抑制与本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括融合在一起的以下元件：(i)任选的位于N端的信号肽；(ii)第一蛋白元件；(iii)第二蛋白元件；以及(iv)与第一蛋白元件和/或第二蛋白元件连接的免疫球蛋白元件，其中，所述信号肽可操作地连于由(ii)、(iii)和(iv)所构成的融合元件；并且第一蛋白元件为TGF‑β受体膜外区蛋白元件；第二蛋白元件为包括血管内皮细胞生长因子受体VEGFR1第二膜外区D2的蛋白元件。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：田文志，
申请(专利权)人：华博生物医药技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31