本发明专利技术公开了一种双靶向抗肿瘤重组蛋白，包括EGFRi、RGD肽基因和MAP30基因，通过非极性疏水柔性接头(Gly4ser)3按顺序将EGFRi、RGD肽基因和MAP30基因融合成完整的EGFi-RGD-MAP30分子，所述的重组蛋白EGFi-RGD-MAP30的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术还提供上述重组蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明专利技术重组蛋白的抗肿瘤药物具有双靶向作用，可特异性与肿瘤细胞表面高表达EGFR受体和肿瘤新生血管内皮细胞相结合，提高对肿瘤细胞的杀伤力，减少对正常组织细胞的不良作用，具有重要的社会效益和巨大的市场应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及。
技术介绍
恶性肿瘤是目前威胁人类健康的最重要的疾病之一，世界上平均每年有超过1000 万人被确诊为癌症，占全世界死亡人数的12%。是人类健康和生命的头号杀手，发病率居 10种重大疾病的第二位。我国每年死于癌症的患者超过100万，而且发病率依然呈上升趋 势。专家预测世界抗癌药物的市场年递增10%以上。目前的抗肿瘤药物大多缺乏对肿瘤细 胞的靶向性，因此毒副作用比较大，开发特异性、高效性的抗肿瘤药物是人类的迫切期望。 近年来，针对某些受体、基因或关键物质的靶向治疗药物正在成为药物研制的重要方向，分 子靶向治疗药物成为近年来肿瘤治疗中的一大热点。靶向治疗药物被认为是未来癌症治疗 中最具有前景的研宄方向。 MAP30 (Momordica anti-HIV protein of 30kD)蛋白是萌芦科植物苦瓜中一种具 有抗HIV活性的核糖体失活蛋白，对多种肿瘤均具有较强的抗肿瘤活性，能诱导肿瘤细胞 凋亡，是一种很有前景的抗肿瘤候选新药。但MAP30作为抗肿瘤药物而言，存在一个严重问 题，即MAP30属于异源蛋白，在人体内多次使用后很有可能会产生免疫原性、毒副作用等， 因此如何改造 MAP30并提高它的抗肿瘤靶向性，增强其抗癌效果，降低毒副作用，是一个亟 待解决的重要课题。同时天然植物中MAP30含量少且提取效率不高，因此利用基因工程方 法生产MAP30重组蛋白已成为必然的发展方向。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的缺陷，目的在于提供一种双靶向抗肿瘤重组蛋白。 本申请通过将MAP30基因序列与EGF受体干扰序列（EGFRi)和RGD序列融合在一 起，中间通过接头（Gly4Ser) 3连接起来，体外构建EGFRi-RGD-MAP30融合基因，并将该融合 基因与pET32a (+)表达载体连接起来，并通过体外诱导表达目标蛋白，纯化制备兼具抗血 管导向、抗肿瘤导向的双靶向的重组蛋白药物。 本专利技术具体通过以下技术方案实现： 一种双靶向抗肿瘤重组蛋白，包括EGFRi、R⑶肽基因和MAP30基因，通过非极 性疏水柔性接头（Gly4ser) 3按顺序将EGFRi、RGD肽基因和MAP30基因融合成完整的 EGFi-RGD-MAP30 分子。 所述的EGFRi肽氨基酸序列为SEQ ID NO. 1，所述的R⑶肽氨基酸序列为SEQ ID NO. 2 〇 本专利技术所述的重组蛋白EGFi-RGD-MAP30的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 3 所示。 另一方面，本专利技术还提供一种抗肿瘤药物，所述药物以本专利技术提供的上述重组蛋 白为活性成分，具有增强药物的抗肿瘤活性，减少毒副作用。 toon] 又一方面，本专利技术还提供上述重组蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。 本专利技术所述的抗肿瘤药物中还可以含有一种或多种药学上可以接受的载体。所述 载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表 面活性剂、吸附载体和润滑剂等。本专利技术的抗肿瘤药物可以制成冻干粉针剂及注射液等形 式，各种剂型均可以按药学领域的常规方法制备。 本专利技术所述的含有上述重组蛋白的抗肿瘤药物具有双靶向作用，所述的双靶向为 与肿瘤细胞表面的EGFR受体和肿瘤新生血管内皮细胞相结合。 本专利技术的有益效果为：本专利技术双靶向抗肿瘤药物EGFRi-RGD-MAP30重组蛋白，其 中EGFi肽是EGFR受体干扰序列，它可以特异性地与肿瘤细胞表面高表达的EGFR结合，但 不具有EGF刺激肿瘤细胞增殖的作用。R⑶小肽则发挥靶向性地与肿瘤新生血管内皮细胞 表面α V β3、α V β5整合素相结合，可以将药物导向肿瘤新生血管处富集，一方面提高 对肿瘤细胞的杀伤力，另一方面减少对正常组织细胞的不良作用。因此该药物的研制将弥 补肿瘤放疗、化疗的不足，为广大肿瘤患者带来福音，将可以延长肿瘤病人的生命、改善肿 瘤病人的生活质量，具有十分重要的社会效益和巨大的市场应用价值。【附图说明】 图1是本专利技术pET32a⑴-ΜΑΡ30双酶切鉴定图；M :DNA Marker (从上至下分别为 2000, 1000, 750, 500, 250, IOObp) ;1:双酶切产物（KpnI+EcoRI) ;MAP30 基因大小为 789bp ; 图2是MAP30基因（KpnI+EcoRI双酶切回收产物）再经过HpaI酶单切电泳图；M : DNA Marker (从上至下分别为 2000, 1000, 750, 500, 250, IOObp) ;1:单酶切产物（HpaI); 图 3 是 PCR 扩增 ELRL 肽（EGFRi-Linker-RGD-Linker, ELRL)基因的电泳图；M :DNA Marker (从上至下分别为 2000, 1000, 750, 500, 250, IOObp) ;1 ~8 :PCR 扩增产物； 图4是以连接产物（ELRL+MAP30)为模板扩增全长融合基因 ELRL-MAP30的电泳 图；M :DNA Marker (从上至下分别为 2000, 1000, 750, 500, 250, IOObp) ;1 :0· 5 μ 1 模板扩增 产物（无目的条带）；2:1μ1模板扩增产物（无目的条带）；3:1·5μ1模板扩增产物（目 的条带大小与预期一致）； 图5是重组质粒的菌落PCR扩增鉴定；M :DNA Marker (从上至下分别为 2000, 1000, 750, 500, 250, IOObp) ;1~11 :不同克隆的菌落PCR产物（第8,9泳道符合预期 条带大小）； 图6是pTA2/ELRL-MAP30重组质粒的双酶切电泳；M :DNA Marker (从上至下分别 为 2000, 1000, 750, 500, 250, IOObp) ;1:双酶切产物（KpnI+EcoRI); 图7是重组pET32a(+)/ELRL-MAP30质粒双酶切电泳鉴定；M :DNA Marker (从上至 下分别为 2000, 1000, 750, 500, 250, IOObp) ;1 :对照组（pTA2/ELRL-MAP30 经 KpnI+EcoRI 双 酶切）；2~5 :重组质粒酶切鉴定（pET32a(+)/ELRL-MAP30质粒经KpnI+EcoRI双酶切）； 图8是目标菌落的小量表达鉴定；M :Protein Marker (从上至下分别为 97, 66, 43, 30, 20, 14kD) ;1 :BL21空菌株对照；2 :重组工程菌未诱导对照；3 :0. 02mM IPTG， 25°〇诱导；4:0.0411111?了6,25°〇诱导；5 :0.0611111?了6,25°〇诱导；6:0.111111?了6,25°〇诱 导； 图9是目标菌落的大量表达鉴定；M :Protein Marker (从上至下分别为 97, 66, 43, 30, 20, 14kD) ;1 :未诱导上清；2 :未诱导沉淀；3 :0· ImM IPTG，25°C诱导上清；4 : 0· ImM IPTG，25°C诱导沉淀；5 :0· 06mM IPTG，25°C诱导上清；6 :0· 06mM IPTG，25°C诱导本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双靶向抗肿瘤重组蛋白，其特征在于：包括EGFRi、RGD肽基因和MAP30基因，通过非极性疏水柔性接头(Gly4ser)3按顺序将EGFRi、RGD肽基因和MAP30基因融合成完整的EGFi‑RGD‑MAP30分子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱振洪，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。