本发明专利技术公开了一种胰高血糖样素肽-1的融合蛋白、其制备方法及其药物组合物。一种胰高血糖样素肽-1的融合蛋白，其特征是，具有通式Ⅰ，GLP-1—SGTPTPTPTPTGEF—融合蛋白 通式Ⅰ其中连接肽为，SGTPTPTPTPTGEF；融合蛋白为：疏水蛋白。其制备方法：首先构建编码疏水蛋白的DNA；然后构建GLP-1的DNA、融合蛋白载体；最后重组表达GLP-1融合蛋白本。胰高血糖样素肽-1的融合蛋白与一种或多种药学上可接受的辅料共同制成药物组合物。GLP-1融合蛋白能够有效增加GLP-1的口服稳定性，并同时增加其血液半衰期，克服其因为半衰期短而无法在临床上使用，尤其是口服使用的现状。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及糖尿病相关的药物领域，具体而言，本专利技术涉及具有延长胰高血糖素 样肽类体内半衰期的重组蛋白，及其制备方法和药物组合物，以及在制备糖尿病药物方面 的应用。
技术介绍
本专利技术涉及的胰高血糖样素肽-I (GLP-1, glucagon-likepeptide-1,以下简 称：GLP-1)主要是由小肠 L细胞分泌的一种37个氨基酸组成的多肽，其活性形式为 GLP-I (7-37)0H 和 GLP-I (7-36)NH2(Mojsov S，J Clin Invest. 1987Feb;79(2):616-9)。 GLP-I有明显减低人用餐后的血糖，能刺激胰岛素的产生，同时还能起到一定减肥效应，并 且不会引起低血糖症（Drucker D J, Diabetes. 1998 Feb ;47(2) :159-69)。近期研究还表 明 GLP-I 对胰腺再生作用（Drucker D J, 2003Dec ; 144 (12) :5145-8)。然而，GLP-I (7-37) 的血清半衰期仅仅为3-5分钟，涉及GLP-I肽的治疗用途，来自蜥蜴唾液的人的GLP-I类似 物Exendin-4的合成物Exenatide, 2005年在美国作为降糖药上市，血中的半衰期到2. 5小 时左右，每天需要在早饭及晚饭前注射给药，每天多次注射给药在临床使用中非常不方便， 因此，延长GLP-I类似物的体内时间对于方便临床应用具有重要的意义。 目前已经有不少研究采用GLP-I类似物融合蛋白技术解决GLP-I类似物在体 内的存留时间，然而，现 有的技术与临床理想的目标还有很大距离。本专利技术是针对现有技术的不足，采用融合蛋白 技术克服了 GLP-I半衰期短的问题。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是针对GLP-I是多肽分子，无法进行口服吸收的缺陷，通过与 疏水蛋白的融合表达形成一个具有稳定结构的、稳定的、可口服的治疗2型糖尿病药物。 本专利技术的另一个目的是提供含有通式I结构的GLP-I融合蛋白作为有效成分以 及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药用组合物，及其在制备糖尿病治 疗药物中的应用。 现结合本专利技术的目的对本专利技术逐一加以描述。 本专利技术胰高血糖样素肽-1的融合蛋白如下述所示：具有通式I， GLP-1- -融合蛋白 通式 I 其中， 连接肽为 SGTPTPTPTPTGEF ; GLP-I的氨基酸序列为： 7-haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr-36 融合蛋白为：疏水蛋白，其氨基酸序列为QQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVIS DVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV。 本专利技术的通式I的GLP-I融合蛋白是通过下述方法制备的： 1.构建编码本专利技术的融合蛋白的DNA 本专利技术中的融合蛋白为疏水蛋白，本专利技术采用标准的PCR(聚合酶链式反应）方法 对相关的融合蛋白的mRNA进行扩增，并按照领域内众所周知的方法进行DNA扩增，疏水蛋 白的DNA序列SEQ ID NO 1。 2.构建本专利技术中GLP-I的DNA 本专利技术参考专利CN1363654A中GLP-I中双链DNA全长的合成方法，进行GLP-I双 链DNA全长的合成，本专利技术中GLP-I经过标准的DNA测序进行序列验证。 3.构建本专利技术中GLP-I融合蛋白载体 利用本领域常规的PCR突变技术制备连接有连接短肽的GLP-I用以与蛋白表达质 粒的连接；连接技术是本领域常规操作，本专利技术利用PCR将含有连接肽的GLP-I与蛋白表达 质粒通过T4连接酶（可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5' -P末端和3' -OH末端之 间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子）进行连接，得到本专利技术中所有融合 蛋白的表达载体。一旦产生了编码完整融合蛋白的表达载体，它可以用来传染酵母菌株，生 产融合蛋白。重组DNA载体转化或转染细胞的技术是本领域的常规技术。 4.用于重组表达本专利技术的融合蛋白的一般方法 用本专利技术中的表达载体转染或转化宿主细胞，用于表达融合蛋白。参考本领域 常规的蛋白表达技术优化本专利技术中各种融合蛋白的表达，用于增加细胞培养物的原则、技 术（例如培养基、温度、pH 等）可以参见 Mammalian Cell Biotechnology :A Practical Approach, M. Butler。本专利技术中的GLP-I融合蛋白的表达采用装载pPIC9质粒的酵母菌株。 5.本专利技术融合蛋白的纯化： -旦本专利技术的融合蛋白在适当的宿主细胞中表达，可以通过标准的蛋白分离和纯 化技术对本专利技术中的融合蛋白进行纯化。例如根据融合蛋白表达载体内的标签进行融合蛋 白的粗提纯。本专利技术中，纯化后的融合蛋白可以通过超滤方法将其浓缩至药用浓度，融合蛋 白经过紫外线的处理用以增加其药用的安全性。 本专利技术的融合蛋白的表征： 本专利技术中，可以用许多方法表征本专利技术的融合蛋白。这些方法中的一些包括：与蛋 白染色偶联的SDS-PAGE或免疫印迹技术。本专利技术中的融合蛋白通过免疫印迹的鉴定，例如 使用GLP-I的抗体。 本专利技术的组合物： 本专利技术所的GLP-I融合蛋白，可以与一种或多种药学上可接受的辅料共同制成药 物组合物，这些辅料包括：水溶性填充剂辅料、PH调节剂、稳定剂、注射用水、滲透压调节剂 等等。该药物组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型为冻干或 溶液注射剂。 本专利技术所述的水溶性填充剂辅料包括：甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二 醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等一种或几种的组合。PH调节剂是枸橼酸、磷酸、盐酸等非挥发性 的酸以及氢氧化钾、氢氧化钠、或钾或铵、碳酸钠或钾或铵盐、碳酸氢钠或钾或铵盐等生理 可接受的有机或无机酸和碱及盐； 稳定剂是EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠）、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷 酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫 酸钠或三羟甲基氨基甲烷的一种或几种的组合。优选焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚 乙二醇6000、三羟甲基氨基甲烷的一种或几种的组合。 滲透压调节剂，是氯化钠、氯化钾的一种或两种的组合。 所述注射制剂的制备方法包括以下步骤： (1)冻干剂 取GLP-I融合蛋白和水溶性填充剂、稳定剂、滲透压剂等，加入注射用水适量，调 节PH值至5-8. 5使其溶解，加水至刻度，加入0. 1-0. 5 %活性炭，在10-25°C下搅拌10-20分 钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得白色疏松块状物， 封口即得。 (2)溶液注射液 取GLP-I融合蛋白和水溶性填充剂、稳定剂、滲透压剂等，加入注射用水适量，调 节PH值至5-8. 5使其溶解，加水至刻度，加入0. 1-0. 5%活性炭，在10-25°C下搅拌10-20 分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，封口即得。 ⑶口服制剂 本专利技术提供的GLP-I融合蛋白也可直接作为口服药物用于治疗2型糖尿病。 本专利技术所的GLP-I融合蛋白具有更长的体内存留时间，可作为有效成分制备糖尿 病治疗药物。相当宽的剂量范围内是本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种胰高血糖样素肽‑1的融合蛋白，其特征是，具有通式Ⅰ，GLP‑1—SGTPTPTPTPTGEF—融合蛋白通式Ⅰ其中连接肽为，SGTPTPTPTPTGEF；融合蛋白为：疏水蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李瑛，乔明强，高井珍，伊秀林，高万才，江立新，
申请(专利权)人：李瑛，
类型：发明
国别省市：天津;12
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