长效非洲爪蟾胰高血糖素样肽‑1（GLP‑1）类似物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种长效非洲爪蟾胰高血糖素样肽‑1（GLP‑1）类似物及其合成方法和应用。通过对非洲爪蟾GLP‑1进行PEG化修饰，得到降糖活性保持和具有更长药理作用时间的非洲爪蟾GLP‑1类似物。本发明专利技术的非洲爪蟾GLP‑1类似物合成收率高、成本低，类似物的半衰期显著延长，生物活性得以显著提高。

【技术实现步骤摘要】
长效非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其应用
本专利技术涉及一种长效非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物及其应用。
技术介绍
糖尿病(DiabetesMellitus)是一种与遗传因素有关，又与多种环境因素相关的慢性全身性疾病，是由于体内胰岛素分泌的绝对或相对不足而引起的糖、脂肪、蛋白质的代谢紊乱，可分为胰岛素依赖型糖尿病(1型)和非胰岛素依赖型糖尿病(2型)，其中2型患者占糖尿病病例的80％以上。糖尿病是一种全球性的高发病，据世界卫生组织预测，到2025年全世界糖尿病患者将达到3亿。中国近期一项流行病学调查报告表明，中国糖尿病患病率高达9.7％，远高于全球平均患病率6.4％，按此患病率估算，我国糖尿病患病人数已超过9000万，并且还有约1.5亿潜在的糖尿病危险人群。目前对于1型糖尿病的治疗，研究方向是开发给药方便、有效的胰岛素制剂及代用品。而对于2型糖尿病的治疗，临床治疗手段主要是使用口服降糖药物，传统的磺酰脲类和双胍类口服降糖药疗效有限，口服糖尿病药物在治疗2型糖尿病症中最大的不足是无法逆转糖尿病的病因，即“治标不知本”，对于胰岛β细胞的生长、分化、增殖无明显作用。胰高血糖素样肽-1(glucagonlikepeptide-1,GLP-1)是小肠L细胞分泌的一种多肽类肠促胰岛素。自1987年Mojsov发现GLP-1具有强的促胰岛素释放作用以来，有关的生物学和化学研究不断深入。GLP-1可通过多种机制控制2型糖尿病患者的血糖，当血糖浓度升高时，通过与GLP-1受体高度特异性地结合，刺激胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的产生，使餐后血糖降低并维持在恒定水平。在生理条件下，GLP-1刺激胰岛素分泌的作用依赖于血糖浓度，不会因持续分泌而发生低血糖。除了调节血糖，GLP-1最显著的功能是促进β细胞的再生和修复，增加胰岛β细胞数量。此外GLP-1还具有调节神经功能、延迟胃排空和降低食欲等作用。然而内源性或外源性的GLP-1在体内会迅速被二肽基肽酶IV(DPP-IV)和中性内切酶(NEP24.11)降解而失去生物活性，其体内半衰期只有两分钟左右，故天然GLP-1难以获得临床使用。虽然GLP-1在2型糖尿病治疗中的显著效果已被人们所公认，但是其体内过短的半衰期限制了其直接成药的可能。DPP-IV是使天然GLP-1失活的主要蛋白酶，其作用位点是Ala8-Glu9之间的肽键。天然GLP-1的另一个主要代谢酶是NEP24.11，约50％的GLP-1在体内会被NEP24.11降解，GLP-1肽链上有多个NEP24.11的酶切位点，主要是Thr11-Phe12、Asp15-Val16、Ser18-Tyr19、Glu27-Phe28和Trp31-Leu32位点。因此，仅置换个别氨基酸无法抗NEP24.11降解，而多个氨基酸置换可能会使化合物的降糖活性下降。目前大部分长效GLP-1受体激动剂的研究都是针对GLP-1的结构进行修饰，这限制了新型GLP-1受体激动剂的研发。同时，由于天然GLP-1上存在较多NEP24.11酶切位点，很难通过氨基酸修饰的手段抵抗NEP24.11的降解。哺乳动物体内的GLP-1作用效果与人GLP-1类似，所以针对哺乳动物GLP-1进行结构修饰，有望发现新型GLP-1类似物。目前延长多肽、蛋白药物半衰期的方法主要基于三种原理:1、增大蛋白药物的分子量，减少肾小球滤过率；2、利用游离型药物和结合型药物在血浆内形成平衡的特点，缓慢释放游离型蛋白药物，使结合型药物和游离型药物的平衡向游离型药物方向移动；3、减少异源蛋白的免疫原性，从而减少其体内清除率。根据以上提示，我们推测如果能够在肽链上引入大分子基团，增加多肽分子量的同时降低多肽的免疫源性，可以显著的延长多肽的半衰期。所以，我们设计了大分子PEG化合物，通过马来酰亚胺与半胱氨酸改构的非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物相连接，从而延长类似物的体内生物活性作用时间和增加其降糖、减肥活性。
技术实现思路
本专利技术涉及一类非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物。其特征在于其结构为以下形式：His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21(SEQ.IDNO:1)其中：Xaa1:Ala，Leu，Val，Met，Ile，Tyr，Phe，Arg，Asn，Lys，Thr，Asp，His，Trp，Gln，Glu，Ser或Gly；Xaa2:Cys(S-PEGanolog)，或Thr；Xaa3:Cys(S-PEGanolog)，或Glu；Xaa4:Cys(S-PEGanolog)，或Tyr；Xaa5:Cys(S-PEGanolog)，或Leu；Xaa6:Cys(S-PEGanolog)，或Glu；Xaa7:Cys(S-PEGanolog)，或Glu；Xaa8:Cys(S-PEGanolog)，或Lys；Xaa9:Cys(S-PEGanolog)，或Ala；Xaa10:Cys(S-PEGanolog)，或Ala；Xaa11:Cys(S-PEGanolog)，或Lys；Xaa12:Cys(S-PEGanolog)，或Glu；Xaa13:Cys(S-PEGanolog)，或Phe；Xaa14:Cys(S-PEGanolog)，或Ile；Xaa15:Cys(S-PEGanolog)，或Glu；Xaa16:Cys(S-PEGanolog)，或Trp；Xaa17:Cys(S-PEGanolog)，或Leu；Xaa18:Cys(S-PEGanolog)，或Ile；Xaa19:Cys(S-PEGanolog)，或Lys；Xaa20:Cys(S-PEGanolog)，或Gly；Xaa21:Cys(S-PEGanolog)-NH2，或Lys-NH2；前提是所述序列不是His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH2其中Cys(S-PEGanolog)选自这里，n选自30～60。优选，S-PEGanolog的分子量为～2000。在一个实施方案中，本专利技术涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1类似物：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Cys(S-PEGanolog)-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH2(SEQ.IDNO:2)在一个实施方案中，本专利技术涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1类似物：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Cys(S-PEGanolog)-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有式Ⅰ(SEQ.ID NO：1)结构的非洲爪蟾胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)类似物；其特征在于其结构为以下形式：His‑Xaa1‑Glu‑Gly‑Thr‑Tyr‑Thr‑Asn‑Asp‑Val‑Xaa2‑Xaa3‑Xaa4‑Xaa5‑Xaa6‑Xaa7‑Xaa8‑Xaa9‑Xaa10‑Xaa11‑Xaa12‑Xaa13‑Xaa14‑Xaa15‑Xaa16‑Xaa17‑Xaa18‑Xaa19‑Xaa20‑Xaa21(SEQ.ID NO:1)其中：Xaa1:Ala，Leu，Val，Met，Ile，Tyr，Phe，Arg，Asn，Lys，Thr，Asp，His，Trp，Gln，Glu，Ser或Gly；Xaa2:Cys(S‑PEG anolog)，或Thr；Xaa3:Cys(S‑PEG anolog)，或Glu；Xaa4:Cys(S‑PEG anolog)，或Tyr；Xaa5:Cys(S‑PEG anolog)，或Leu；Xaa6:Cys(S‑PEG anolog)，或Glu；Xaa7:Cys(S‑PEG anolog)，或Glu；Xaa8:Cys(S‑PEG anolog)，或Lys；Xaa9:Cys(S‑PEG anolog)，或Ala；Xaa10:Cys(S‑PEG anolog)，或Ala；Xaa11:Cys(S‑PEG anolog)，或Lys；Xaa12:Cys(S‑PEG anolog)，或Glu；Xaa13:Cys(S‑PEG anolog)，或Phe；Xaa14:Cys(S‑PEG anolog)，或Ile；Xaa15:Cys(S‑PEG anolog)，或Glu；Xaa16:Cys(S‑PEG anolog)，或Trp；Xaa17:Cys(S‑PEG anolog)，或Leu；Xaa18:Cys(S‑PEG anolog)，或Ile；Xaa19:Cys(S‑PEG anolog)，或Lys；Xaa20:Cys(S‑PEG anolog)，或Gly；Xaa21:Cys(S‑PEG anolog)‑NH...

【技术特征摘要】
1.一种含有式Ⅰ(SEQ.IDNO：1)结构的非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物；其特征在于其结构为以下形式：His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21(SEQ.IDNO:1)其中：Xaa1:Ala，Leu，Val，Met，Ile，Tyr，Phe，Arg，Asn，Lys，Thr，Asp，His，Trp，Gln，Glu，Ser或Gly；Xaa2:Cys(S-PEGanolog)，或Thr；Xaa3:Cys(S-PEGanolog)，或Glu；Xaa4:Cys(S-PEGanolog)，或Tyr；Xaa5:Cys(S-PEGanolog)，或Leu；Xaa6:Cys(S-PEGanolog)，或Glu；Xaa7:Cys(S-PEGanolog)，或Glu；Xaa8:Cys(S-PEGanolog)，或Lys；Xaa9:Cys(S-PEGanolog)，或Ala；Xaa10:Cys(S-PEGanolog)，或Ala；Xaa11:Cys(S-PEGanolog)，或Lys；Xaa12:Cys(S-PEGanolog)，或Glu；Xaa13:Cys(S-PEGanolog)，或Phe；Xaa14:Cys(S-PEGanolog)，或Ile；Xaa15:Cys(S-PEGanolog)，或Glu；Xaa16:Cys(S-PEGanolog)，或Trp；Xaa17:Cys(S-PEGanolog)，或Leu；Xaa18:Cys(S-PEGanolog)，或Ile；Xaa19:Cys(S-PEGanolog)，或Lys；Xaa20:Cys(S-PEGanolog)，或Gly；Xaa21:Cys(S-PEGanolog)-NH2，或Lys-NH2；前提是所述序列不是His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH2。2.根据权利要求1所述的肽，其中Cys(S-PEGanolog)选自这里：n选自30～80。3.根据权利要求2所述的化合物，其中优选的S-PEGanolog的分子量为～2000。4.根据权利要求1-3所述的非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，优选的序列为：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Cys(S-PEGanolog)-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH2(SEQ.IDNO:2)；His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Cys(S-PEGanolog)-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-NH2(SEQ.IDNO:3)；His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Cys(S-PEGanol...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩京，傅俊杰，崔旭，周凤，费颖颖，张莹，司鹏斌，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32