一种综合评价内分泌干扰作用的方法-非洲爪蟾模型技术

本发明专利技术提供一种综合评价内分泌干扰作用（活性）的方法：它以非洲爪蟾作模型动物，在蝌蚪的早期发育阶段开始予以测试物暴露处理，直至完全变态，以变态发育和性腺发育的某些特征为终点测试指标，评价测试物的甲状腺系统干扰作用和雌雄激素系统干扰作用。此方法的优点是能够同时评价测试物的甲状腺系统干扰作用和雌雄激素系统干扰作用，并且具有一定的敏感性；另外，该方法还为甲状腺系统干扰机制和雌雄激素系统干扰机制的研究提供了一个平台。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及评价内分泌干扰作用(活性)的方法和动物模型，特别是评价雌雄激素系统和甲状腺激素系统干扰作用的方法和动物模型。
技术介绍
内分泌干扰物是目前环境科学研究领域的一个热点问题。该类物质通过干扰内分泌系统而影响动物或人的正常生长发育和繁殖以至对个体、后代或种群产生毒理效应。目前已发现鱼类孵化率生存率的降低和雌性化现象、爬行动物的性别逆转和性腺畸形以及鸟类蛋壳变薄、孵化率降低、性发育异常、性行为紊乱等都与内分泌干扰作用有关。大量的流行病学资料显示人类的激素类癌症(如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌)发生率的提高、男性精子数量和质量的降低也与内分泌干扰作用有关。已确定的内分泌干扰物包括多氯联苯、多溴联苯、烷基酚、双酚A、酞酸酯等工业产品，DDT、林丹、阿特拉津等农药和激素类药物及植物雌激素等几类。这些内分泌干扰物广泛存在于环境中威胁着动物和人体的健康。鉴于内分泌干扰物存在的广泛性和内分泌干扰作用危害的严重性，内分泌干扰作用的研究就显得十分必要了。其中，建立评价内分泌干扰作用的方法是该领域研究的一个重要环节一方面，利用这些方法可以检测出环境中潜在的内分泌干扰物并确证其内分泌干扰活性；另一方面，用某些典型的方法做平台来研究内分泌干扰作用的机制。目前已有一些成熟的评价内分泌干扰作用的方法，如细胞增殖试验，受体结合试验，子宫增重试验等，这些方法各有优缺点。比如细胞增殖、受体结合等体外试验能快速地对内分泌干扰物进行筛查，但敏感性和特异性有一定的局限，而且这些方法只是针对通过某一种干扰途径实现内分泌干扰作用的物质，而对那些通过其它途径实现内分泌干扰作用的物质则无法评价；同时，体外方法无法真正探测到内分泌干扰物质在体内发生作用的情况。另外，有些研究机构正在建立评价内分泌干扰作用的鱼类模型、鸟类模型、哺乳动物模型。鱼类模型包括性腺复苏试验、未成年鱼试验等，这些试验虽然简便易行，但终点指标单一，只能评价对雌雄激素系统的干扰作用；两代哺乳动物生殖模型是最具综合性也最复杂的生殖发育毒理试验，用它来评价内分泌干扰作用当然能得到许多综合性的信息。但是，哺乳类动物因为其发达的生理调节能力尤其发达的内分泌系统调节能力，决定了这类动物对内分泌干扰作用的敏感性相对较低；同时因为该模型操作的复杂和费用的昂贵，限制了它在大多数实验室的实用性。所以这个模型只适合用来评价个别的内分泌干扰物的作用及进行深一步的机制问题研究，而不适合作为一个常规的评价内分泌干扰作用的方法在实验室广泛推广。鸟类生殖模型也存在与两代哺乳动物生殖模型相同的问题。
技术实现思路
为克服现有评价内分泌干扰作用的方法的不足，本专利技术提供一种综合评价内分泌干扰作用(活性)的非洲爪蟾模型。本模型的技术路线是在非洲爪蟾发育的特定阶段暴露测试物，并保持测试物的浓度，在发育的特定阶段选择终点测试指标对测试物的内分泌干扰作用进行评价。终点测试指标包括前腿展开率、前腿展开(58阶段)到完全变态(66阶段)所用的时间、雌雄比例和性腺形态等。本模型可相对快速地对测试物的内分泌干扰作用做出评价，具体优势表现为1.模型动物非洲爪蟾终生生活在水中，在实验室容易饲养；终年可以孵卵繁殖，而且每次产卵很多，利于开展毒理研究；2.特有的生活习性和皮肤的高渗透性使非洲爪蟾对环境中的毒害作用具高敏感性。美国的一些环境健康研究组织也认为两栖动物是很好的评价环境健康的前哨动物；3.非洲爪蟾的性腺发育对外源雌/雄激素十分敏感，所以其性腺发育可作为评价雌雄激素系统干扰作用的终点指标；同时非洲爪蟾要经过一个由甲状腺激素系统控制的变态过程，其变态发育对甲状腺激素系统的干扰具敏感性，所以变态发育可作为评价甲状腺激素系统的干扰的终点指标；4.本模型所确定的终点指标可操作性强。变态的定性定量描述、性腺的鉴别、组织切片的制作等都是实验室常规试验，很容易操作，且费用相对也较低；5.更重要的是非洲爪蟾是研究动物胚胎发育的经典模型动物，在实验室广泛使用多年。基于对非洲爪蟾的研究，人类已获取了大量关于胚胎发育、变态发育、器官发生等过程及机制的多层次的信息。同时非洲爪蟾也被用于毒理学研究，尤其胚胎致畸分析是经典的致畸实验模型。所有这些关于非洲爪蟾生长发育繁殖的信息都可作为重要参考借鉴于建立评价内分泌干扰作用的模型中。这是非洲爪蟾所具有的其它种属所不可比拟的优势，所以本模型有很大的发展空间；6.两栖动物作为一个大的生物分类种群，其受到内分泌干扰物质的影响应该受到关注。所以，非洲爪蟾模型作为一个评价内分泌干扰物质对两栖动物的干扰作用的模型是其它模型所不能替代的；6.最后，非洲爪蟾模型为甲状腺激素系统干扰机制和雌雄激素系统干扰机制的研究提供了一个平台。具体实施例方式性成熟的雌蛙、雄蛙隔离喂养，室温保持在22±2℃。每周喂一次猪肝换一次水。实验用水为活性炭除氯的自来水。晚上雌蛙腹腔注射700IU HCG，雄蛙注射300 IU HCG，放入孵化缸。次日凌晨抱对产卵，产卵完毕移出亲蛙，静置孵化。室温保持在22±2℃，明∶暗光周期12小时∶12小时。受精第5天末开始暴露试验。选择健康活泼的蝌蚪随机分3缸组，每缸30只。根据测试物的特性设计浓度梯度，每给浓度设两个平行缸。100μg/L雌二醇作性腺干扰和变态干扰的阳性对照。每4天换一次水，随后加药。每天记录蝌蚪的生长死亡情况。终点测试指标包括1.前腿展开率。蝌蚪生长大概60天后陆续展开前腿，这标志着变态高潮期的开始。每天记录展开前腿的蝌蚪占蝌蚪总数的百分比。最后用one-way ANOVA统计方法做差异显著性分析(P＜0.05)。一般情况下非洲爪蟾变态进入高潮期的时间是比较一致。如果通过统计分析显示，测试物组的前腿展开率明显高于或低于对照组，则表明测试物促进或抑制了非洲爪蟾的变态过程；2.前腿展开(58阶段)到完全变态(66阶段)所用的时间。一般情况下非洲爪蟾从前腿展开到完全变态所用的时间是一定的。如果这一时间被缩短或延长则表明测试物促进或抑制了非洲爪蟾的变态过程。3.雌雄比例。爪蟾完全变态大约一个月后，解剖性腺，鉴别雌雄，并立即将性腺投入到Bouin’s固定液中固定以备制作切片。非洲爪蟾正常的雌雄比大概是1∶1，如果通过t检验发现测试物改变了雌雄比，则表明测试物干扰了非洲爪蟾的性腺发育。4.性腺形态及组织显微结构。用体视显微镜观察性腺的形态并照相，对异常的性腺做石蜡切片并用苏木精-伊红染色。光学显微镜观察并照相。通过比较测试物暴露组和对照组的性腺形态和显微组织结构的差别，更能分析测试物是否干扰了非洲爪蟾的性腺发育。利用此模型，我们发现了几种PCBs对非洲爪蟾性腺发育的干扰作用，几乎所有的雄性都表现出两性特征，这表明非洲爪蟾模型对雌/雄激素系统的干扰作用是敏感的；同时，我们还发现了PCBs对非洲爪蟾变态发育的抑制作用，从而证明了非洲爪蟾模型对甲状腺激素系统干扰作用的敏感性。本文档来自技高网...

【技术保护点】
综合评价内分泌干扰作用（活性）的方法即为非洲爪蟾模型。

【技术特征摘要】
1.综合评价内分泌干扰作用(活性)的方法即为非洲爪蟾模型。2.权利要求1所指的非洲爪蟾模型所使用的动物为非洲爪蟾。3.权利要求1所指的非洲爪蟾模型用于检测内分泌干扰物质，评价内分泌干扰作用。4.权利要求1所指的非洲爪蟾模型还用于内分泌干扰作用机制的研究。5.权利要求1所指的非洲爪蟾模型除评价甲状腺系统干扰作用和雌雄激素系统干扰作用外还可用于评价其它内分泌系统干扰作用。6.权利要求1所指的非洲爪蟾模型还可用于内分泌...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦占芬，周景明，徐晓白，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]