【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种莱茵衣藻nphp8蛋白的兔多克隆抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)属于绿藻纲团藻目衣藻科衣藻属，细胞一般呈现为椭圆形或圆形，主要结构有细胞核、叶绿体和纤毛等。莱茵衣藻基因组大小约为1×108bp，其细胞结构较为简单，生长周期快且容易在实验室进行培养，因此，莱茵衣藻成为纤毛调控、植物光合作用、新陈代谢等诸多实验的研究材料。
2、纤毛是一种游离于细胞表面的活动性毛发状细胞器，主要由纤毛膜、轴丝以及介于纤毛膜与轴丝之间的基质部分组成，具有运动、感知、参与细胞信号通路等功能。由于纤毛缺乏蛋白质合成机制，因此其内部蛋白质等其他物质均是由细胞内合成后转运至纤毛内。在转运过程中需要以纤毛内运输机制(intraflagellar transport，ift)，并且通过纤毛基部过渡区(transitionzone，tz)的分选与调节来进行物质的运输。过渡区位于轴丝底部、基体顶端，是一个135nm的星状结构，由9个双联体微管围成一圈，轴丝微管会向外延伸至纤毛膜，形成一个y型纤维连接结构，称为y-link结构，多个y-link与过渡区的纤维共同组成门控结构，控制着纤毛室蛋白的组成，起到物质的筛选作用。因此，过渡区功能的失调，会影响纤毛的形态结构、物质组成以及信号转导等。许多人类遗传病也是此区域蛋白异常造成纤毛结构与功能紊乱所致。莱茵衣藻是研究真核生物纤毛结构、功能与潜在分子机制的主要模式生物之一，被广泛应用于细胞与分子生物学领域，并且作为纤
3、nphp8是一种进化高度保守的基因，编码一种过渡区蛋白，在调节纤毛形成和功能方面发挥重要作用，例如参与纤毛过渡区组装、自噬和纤毛蛋白酶体的激活等。nphp8突变会导致严重的纤毛病，如朱伯特综合征(joubert syndrome，jbts)、梅克尔-格鲁贝尔综合征(meckel-gruber syndrome，mks)和肾消耗病(nephronophthisis，nphp)，以中枢神经系统畸形、囊性肾、多指、视网膜变性和视网膜营养不良为特征。因此，寻求一种能特异性识别莱茵衣藻nphp8蛋白的抗体及制备方法显得尤为重要。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种莱茵衣藻nphp8蛋白的兔多克隆抗体及其制备方法和应用，该多克隆抗体能特异性识别莱茵衣藻nphp8蛋白，即可特异性标记纤毛过渡区；还可以通过免疫印记法对莱茵衣藻细胞内nphp8蛋白进行定性与定量分析，为以莱茵衣藻为模式生物的纤毛运动、再生、缩短、延长以及纤毛门控与运输等相关调控机制的研究以及纤毛疾病病理机制的深入探究，奠定应用基础。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种莱茵衣藻nphp8蛋白的兔多克隆抗体，所述多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻纤毛过渡区的nphp8蛋白；所述nphp8蛋白的氨基酸序列如序列表seq id no.1所示，所述多克隆抗体的抗原氨基酸序列为rvsdyglaadtrdq和rsrygaetelsle。
3、本专利技术还提供了一种上述的莱茵衣藻nphp8蛋白的兔多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
4、(1)分析与设计莱茵衣藻nphp8蛋白抗原表位，
5、(2)选择1489-1502aa合成多肽片段rvsdyglaadtrdq-c，选择1693-1705aa合成多肽片段c-rsrygaetelsle；
6、(3)将步骤(2)合成的两种多肽片段混合后作为抗原，对兔子进行免疫，最后进行动物采血获得nphp8蛋白兔多克隆抗血清，将抗血清亲和纯化，获得nphp8蛋白的兔多克隆抗体。
7、进一步的，免疫处理方法为：将多肽抗原与完全弗氏佐剂混合，得到第一混合液并注射至免疫兔子体内；12天后，将多肽抗原与不完全弗氏佐剂混合，得到第二混合液并注射至所述免疫兔子体内；14天后，将多肽抗原与不完全弗氏佐剂混合，得到第三混合液并注射至所述免疫兔子体内；14天后，将多肽抗原与不完全弗氏佐剂混合，得到第四混合液并注射至所述免疫兔子体内；14天后，将多肽抗原与不完全弗氏佐剂混合，得到第五混合液并注射至所述免疫兔子体内。
8、本专利技术还提供了一种上述莱茵衣藻nphp8蛋白的兔多克隆抗体在检测莱茵衣藻nphp8蛋白方面中的应用。
9、进一步的，通过免疫荧光if方法或免疫印迹wb方法来检测莱茵衣藻nphp8蛋白。
10、进一步的，通过免疫荧光if方法检测莱茵衣藻nphp8蛋白的步骤如下：
11、将莱茵衣藻细胞以甲醇穿透法固定制片后用封闭液室温封闭1h，用纯化后的nphp8兔多克隆抗体以1:500稀释比于4℃条件下过夜孵育；用含0.5％tween-20的pbsbuffer清洗3次，每次5min；用荧光标记二抗在37℃孵育1h，再用含0.5％tween-20的pbsbuffer清洗3次，每次5min，然后使用不含tween-20的pbs buffer清洗1次，最后使用ddh2o清洗一次，封片后在荧光显微镜下观察nphp8蛋白在纤毛过渡区定位并拍照、作图与分析。
12、进一步的，通过免疫印迹wb方法检测莱茵衣藻nphp8蛋白的步骤如下：
13、将经过冷冻的衣藻细胞样品用细胞裂解液反复吹打，并加入sds buffer混匀后于95℃金属浴10min；随后进行sds-page电泳，其中浓缩胶电泳时间为20min，电压为80v；分离胶电泳时间为80min，电压为120v；进行转膜，条件为80min，100v；将pvdf膜室温封闭1h后用纯化的nphp8兔多克隆抗体以1:5000稀释比于4℃条件下过夜孵育；回收一抗，用1×tbst洗膜3次，每次10min；使用相对应的二抗室温孵育1h，回收二抗，用1×tbst洗膜3次，随后进行显影，对nphp8蛋白进行定性以及定量分析。
14、与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
15、本专利技术多克隆抗体能特异性识别莱茵衣藻nphp8蛋白，且具有效价高和特异性好的特点。该莱茵衣藻nphp8兔多克隆抗体既可以进行免疫荧光if来检测莱茵衣藻nphp8蛋白，特异性标记纤毛过渡区以及多个蛋白共定位分析；也可以通过免疫印迹wb方法对莱茵衣藻nphp8蛋白进行定性与定量分析，为以莱茵衣藻为模式生物的纤毛运动、再生、缩短、延长以及纤毛门控与运输等相关调控机制的研究以及纤毛疾病病理机制的深入探究，奠定应用基础。
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1.一种莱茵衣藻NPHP8蛋白的兔多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻纤毛过渡区的NPHP8蛋白；所述NPHP8蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示，所述多克隆抗体的抗原氨基酸序列为RVSDYGLAADTRDQ和RSRYGAETELSLE。
2.一种如权利要求1所述的莱茵衣藻NPHP8蛋白的兔多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种莱茵衣藻NPHP8蛋白的兔多克隆抗体的制备方法，其特征在于，免疫处理方法为：将多肽抗原与完全弗氏佐剂混合，得到第一混合液并注射至免疫兔子体内；12天后，将多肽抗原与不完全弗氏佐剂混合，得到第二混合液并注射至所述免疫兔子体内；14天后，将多肽抗原与不完全弗氏佐剂混合，得到第三混合液并注射至所述免疫兔子体内；14天后，将多肽抗原与不完全弗氏佐剂混合，得到第四混合液并注射至所述免疫兔子体内；14天后，将多肽抗原与不完全弗氏佐剂混合，得到第五混合液并注射至所述免疫兔子体内。
4.如权利要求1所述的一种莱茵衣藻NPHP8蛋白的兔多克隆抗体在检测莱茵衣藻N
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过免疫荧光IF方法或免疫印迹WB方法来检测莱茵衣藻NPHP8蛋白。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过免疫荧光IF方法检测莱茵衣藻NPHP8蛋白的步骤如下：
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过免疫印迹WB方法检测莱茵衣藻NPHP8蛋白的步骤如下：
...【技术特征摘要】
1.一种莱茵衣藻nphp8蛋白的兔多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻纤毛过渡区的nphp8蛋白；所述nphp8蛋白的氨基酸序列如序列表seq idno.1所示，所述多克隆抗体的抗原氨基酸序列为rvsdyglaadtrdq和rsrygaetelsle。
2.一种如权利要求1所述的莱茵衣藻nphp8蛋白的兔多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种莱茵衣藻nphp8蛋白的兔多克隆抗体的制备方法，其特征在于，免疫处理方法为：将多肽抗原与完全弗氏佐剂混合，得到第一混合液并注射至免疫兔子体内；12天后，将多肽抗原与不完全弗氏佐剂混合，得到第二混合液并注射至所述免疫兔子体内；14天后，将多肽抗原与不完全弗...
【专利技术属性】
技术研发人员：王亮，徐闯，蒋林，李亚，钱蕴瑶，吴怡琼，郁慧敏，芮雪，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：
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