本发明专利技术提供基因编码的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸荧光探针及其制备方法和应用，所述基因编码的NADPH荧光探针，包括：对NADPH敏感的多肽B和对NADPH进行表现的荧光蛋白A；所述对NADPH敏感的多肽B和NADPH相互作用导致荧光蛋白A荧光强度的变化。该NADPH荧光探针可以在体内、体外、亚细胞或原位水平检测NADPH；探针特异性非常好，对于ATP等类似物没有响应，对于NADH等类似物也没有干扰。探针蛋白相对较小且易于成熟，其荧光动态变化大，是一种适合于生理水平和亚细胞特异性的实时检测NADPH的技术。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸基因编码荧光探针及其制备方法 和应用。一方面本专利技术涉及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的检测探针，具体涉及还原 型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的重组荧光融合蛋白检测探针。在又一方面，本专利技术也涉及 上述检测探针的制备方法及其在检测NADPH中的应用。
技术介绍
还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH)是体内重要的辅酶之一，它不仅参与 了细胞内的脂类、脂肪酸和核苷酸等物质的合成代谢反应并为该反应过程提供还原力；还 通过重生还原型谷胱甘肽，硫氧还蛋白等抗氧化物质维持着细胞内的氧化还原势；另外它 也可以通过细胞色素 P450蛋白等参与细胞的去毒反应，降解细胞内的毒性物质；除此之 外，它还可以通过NADPH氧化酶产生活性氧类（R0S)，调苄基因表达、细胞内信号转导和免 疫反应等（Agledal，L.等，Redox R印.2010, V. 15(1)，PP. 2-10)。因此，NADPH 和细胞代谢、 氧化还原代谢和细胞内信号转导等生命过程有紧密的关系，而与NADPH代谢相关的众多酶 类也成为了药物设计的靶标（R〇hle，D.等，Science. 2013, V. 340(6132) :，PP. 626-630)。 但是，大多数细胞内游离的NADPH含量非常低，Ig湿重的小鼠肝脏大约含 有0.1 ymol的NADP(H)，其中绝大部分都是以结合形式存在的（Reiss，P.D.等，Anal Biochem. 1984, V. 140(1)，pp. 162-171)。在不同细胞类型和亚细胞器中，游离的NADPH和 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+)的比例略有变化，例如线粒体中的游离NADPH和NADP 的比例通常高于10:1，而在细胞胞浆中还原状态的NADPH甚至占到了游离NADP(H)部分的 99% 左右（Veech，R.L.等，Biochem J. 1969, V. 115 (4)，pp. 609-619)。早期的紫外分光光度 法是利用NADPH的光吸收性质，但是该方法的灵敏度很差且不能有效地区分还原型烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸（NADH)与NADPH。随后发展的酶学方法是依据NADP +和NADPH可以在酶作 用下互相转化的性质，但是这种检测方法受到外界环境，酶的活性以及分析仪器的灵敏度 限制。另外还有一些物理化学检测方法，如HPLC分析、电化学法、毛细管电泳等，虽然它们 的精度较高，但是在活细胞研究中存在很大的缺陷。它们需要经过耗时的样品处理时间(细 胞破碎、分离提取纯化等)，而NADPH在环境中非常容易氧化，因此这些方法不能应用于细 胞或活体动物的实时准确地检测。这些检测方法测量的是细胞群体，掩盖了细胞之间的差 异，限制了它们在临床疾病诊断及药物前体研究等邻域的应用。目前虽然存在检测NADH和 NADH:NAD+ 比例的基因编码荧光探针（Zhao, Y.等，Cell Metabolism. 2011，V. 14(4)，pp. 55 5-566)，但是它们依然存在荧光强度低，动态变化范围小以及不合适于线粒体检测等劣势， 最为重要的是它们不能用于细胞内NADPH的检测。 虽然目前可以利用自发荧光的方法在细胞或活体上进行NADPH的实时检测，但是 这种方法存在严重的局限性：首先，不能有效的区分NADH与NADPH，由于它们的荧光光谱 完全相同，因而检测的信号是NADH与NADPH总量之和；另外游离的NAD(P)H含量很低，所 以测量的NAD(P)H的自发荧光信号，反映的其实是蛋白质结合的NAD(P)H的荧光（Zhang. Q. Η·等，Science. 2002, V. 295 (5561)，ρρ· 1895-1897);其次，NADPH 的激发波长位于近紫外 区（340nm)，它的穿透力很弱且长时间照射会造成严重的细胞损伤，用于自发荧光检测的仪 器价格也非常昂贵，这些局限性都制约了该方法在活细胞中的应用。因此，本研究领域亟需 发展一种特异性检测NADPH的技术，特别是适合于生理水平的时空特异性检测NADPH的技 术。 相对于传统的小分子化学染料以及迅速发展的量子点检测技术，基因编码的荧光 蛋白探针在活细胞成像方面具有很大优势。基因编码的荧光蛋白探针存在光毒性小、可以 基因编码，并能够通过基因操作的方法在细胞、组织乃至整个器官中进行表达，因此荧光探 针是优异的单细胞代谢小分子的实时指示器。基因编码的荧光蛋白探针是由荧光蛋白和对 配体特异性结合的支架蛋白组成的。 最早发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白GFP(SEQ ID N013)，它是从维多利亚发光水 母（Aequorea victoria)中提取出来的，由238个氨基酸构成，分子量约为26kDa。GFP是由 11条β -折叠链形成了独特的桶状结构，其内包裹着生色三肽（Ser65-Tyr66-Gly67)。当在 氧气存在下，它会自发形成对-羟基苯亚甲基咪唑啉酮的生色团结构而产生荧光。GFP产生 荧光不需要辅因子，而且荧光非常稳定，是一种良好的成像工具。GFP有两个激发峰，395nm 的主峰可产生508nm的发射光，而肩峰475nm的激发光照射则会产生的503nm的发射光 (Heim，R.等，Proc Natl Acad Sci U S A. 1994, V. 91 (26)，PP. 12501-12504)。随着对 GFP 蛋白突变的研究不断深入，目前产生了很多不同颜色的突变体例如荧光增强型绿色荧光蛋 白（eGFP)、黄色荧光蛋白（YFP)、青色荧光蛋白（CFP)、蓝色荧光蛋白（BFPSeq ID N014)， 绿色荧光蛋白（TFP)等。除此之外，科学家还在海洋珊瑚中发现了第一种红色荧光蛋白 (RFP)，经过不断的改造产生了多种商业化的红色荧光蛋白突变体，其中最常用的红色荧光 蛋白，一种是搜桃红突光蛋白mcherry(Seq ID N015)，它的激发峰在587nm，发射峰在621nm (Tsien，R.Y.等，Nat Methods. 2008, V. 5(6)，ρρ· 545-551);另一种是mKate(Seq ID N016)， 它的光谱和 mcherry 类似（Shcherbo，D.等，Nature Methods. 2007, V. 4(9)，ρρ· 741-746) 等。 基因编码的荧光探针的主要构建方式是荧光共振能量转移（FRET)和基于单生色 团的荧光蛋白，其中后者的主要形式是天然荧光蛋白质的环状重排。例如将GFP的原始N 端和C端通过一段柔性的短肽链连接，而在野生型GFP近生色团位置(如Y144和N145位氨 基酸)制造一个新的N端和C端，就可以形成一个对空间构象变化非常敏感的环状排列荧光 蛋白（circularly permuted fluorescent protein)。目前已经创造了多种环状重排的突 光蛋白（cpFP)用于荧光探针的构建，如环状重排蓝色荧光蛋白（cpBFPSeq ID N08)，环状重 排绿色荧光蛋白（cpEGFPSeq ID N07)，环状重排黄色荧光蛋白（cpYFPSeq ID N06)，环状重 排绿色荧光蛋白（cpTFPSeq ID N09)，环状重本文档来自技高网...
【技术保护点】
基因编码的NADPH荧光探针，其特征在于，包括：对NADPH敏感的多肽B和对NADPH进行表现的荧光蛋白A；所述对NADPH敏感的多肽B和NADPH相互作用导致荧光蛋白A荧光强度的变化。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨弋，刘海燕，陶荣坤，初环宇，樊纯，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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