本发明专利技术提供一种鹅支原体体外液体培养基，由培养基A和培养基B组成，培养基A为分解葡萄糖的支原体培养基，培养基B为分解精氨酸的支原体培养基，培养基A的配方为：支原体肉汤基础，去离子水，葡萄糖，丙酮酸钠，1%的酚红，10%的醋酸铊溶液，灭活的马血清，酵母提取液，青霉素，L-半胱氨酸盐酸盐水溶液，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液；培养基B的配方为：支原体肉汤基础，去离子水，丙酮酸钠，1%的酚红，10%的醋酸铊溶液，灭活的马血清，酵母提取液，青霉素，L-精氨酸盐酸盐水溶液。采用本发明专利技术的培养基培养鹅支原体仅24小时即可生长，生长48小时的滴度可达103 CCU/mL；适用于鹅支原体的分离培养和诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于培养基
，具体涉及一种鹅支原体体外液体培养基。
技术介绍
鹅支原体（Mycoplasmaanseris）是造成鹅呼吸道疾病、阴茎和泄殖腔炎症、产蛋下降、无精蛋及死胚增加的病原体。最早由Kosovac和Djurisic从患有输卵管炎的鹅中检测到，随后由Palya于1971年从匈牙利的一只公鹅的生殖器中分离获得，并在之后命名为sp.1220株（Stipkovits，1978、1984、1986、2012）。流行病学调查显示德国、波兰、捷克斯洛伐克、苏联、英国等国家相继从发炎的公鹅生殖器及泄殖腔中分离到鹅支原体。我国是世界上主要的鹅养殖基地，鹅肉产量占全球总量的93%。珠江三角洲地区和扬州等地流行病学调查证实支原体在鹅群中的广泛感染（彭万强，1988；陈志华，2006），通过剖检病鹅，临床病变主要为肝周炎、气囊炎、腹膜炎、泄殖腔炎和阴茎炎，并可见肠壁变薄出血及输卵管积液，本病流行范围广，一年四季均有发生，以产蛋季节最为严重，可在无精蛋、死胚及孵化的雏鹅中分离到支原体，表明鹅支原体不仅可以经蛋垂直传播，也可以通过交配水平传播。鹅支原体是一类特殊的微生物，无细胞壁，由于其基因组较小，造成基因组中编码氨基酸和辅助因子生物合成的基因就少，从而导致能量代谢能力有限；支原体属于氨基酸、脂类和某些辅助因子营养缺陷型，很难对环境变化做出调整，需要从外界摄取多种营养物质促进繁殖，因此对体外培养基的要求相当苛刻；由于不同菌株对葡萄糖、精氨酸两种物质利用的情况不同，支原体对培养基的要求也存在差异；其中利用葡萄糖的鹅支原体在含葡萄糖的培养基中生长并产酸，使酚红试剂变黄；利用精氨酸的支原体可分解培养基中的精氨酸产生氨（NH3），使酚红试剂变红。目前，鹅支原体病与鹅的鸭瘟病、鹅出败病列为我国鹅群感染的三大疫病，相对于鸡毒支原体（Mycoplasmagallispeticum）和滑液支原体（Mycoplasmasymoviae）的研究，我国在鹅支原体分离诊断及防控措施方面的研究仍处于起步阶段，目前分离鹅支原体使用的人工培养基一般均由Frey或PPLO培养基改良而来，但仍存在活菌滴度低，繁殖能力差等问题，再加上鹅群中存在两种生化性质不同的支原体（一种分解葡萄糖，一种分解精氨酸），容易产生假阴性，因此，本领域亟需高效稳定、且能达到快速分离诊断鹅支原体的培养基，进而开展鹅支原体感染的治疗与防控研究。
技术实现思路
本专利技术提供一种生长周期短、活菌滴度高、适用于两种生化特性的鹅支原体体外的分离及传代培养的高效液体培养基，同时提供这种培养基的制备方法。本专利技术的第一个目的是提供一种鹅支原体体外液体培养基，由培养基A和培养基B组成，所述培养基A为分解葡萄糖的支原体体外培养基，所述培养基B为分解精氨酸的支原体体外培养基，其特征在于：所述培养基A的配方为：支原体肉汤基础，去离子水，葡萄糖，丙酮酸钠，1%的酚红，10%的醋酸铊溶液，灭活的马血清，酵母提取液，青霉素，L-半胱氨酸盐酸盐，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；所述培养基B的配方为：支原体肉汤基础，去离子水，丙酮酸钠，1%的酚红，10%的醋酸铊溶液，灭活的马血清，酵母提取液，青霉素，L-精氨酸盐酸盐。作为优选，所述培养基A的配方为：支原体肉汤基础18-23g/L，去离子水680-720mL/L，葡萄糖4-6g/L，丙酮酸钠1.5-3g/L，1%的酚红3-4mL/L，10%的醋酸铊溶液2-3.2mL/L，灭活的马血清150-180mL/L，酵母提取液40-55mL/L，青霉素80-100万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L。进一步优选地，所述培养基A的配方为：支原体肉汤基础21g/L，去离子水700-720mL/L，葡萄糖5g/L，丙酮酸钠2g/L，1%的酚红3mL/L，10%的醋酸铊溶液2.6mL/L，灭活的马血清150mL/L，酵母提取液45mL/L，青霉素80万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L；作为优选，所述培养基B的配方为：支原体肉汤基础18-23g/L，去离子水700-740mL/L，丙酮酸钠1-2g/L，1%的酚红1-1.5mL/L，10%的醋酸铊溶液2-3.2mL/L，灭活的马血清150-180mL/L，酵母提取液40-55mL/L，青霉素80-100万单位/L，L-精氨酸盐酸盐10-12g/L。进一步优选地，所述培养基B的配方为：支原体肉汤基础21g/L，去离子水720-740mL/L，丙酮酸钠1g/L，1%的酚红1mL/L，10%的醋酸铊溶液2.6mL/L，灭活的马血清150mL/L，酵母提取液45mL/L，青霉素80万单位/L，L-精氨酸盐酸盐10g/L。作为优选，所述酵母提取液的制备方法为：将酵母溶于4-6倍重量的去离子水中，在28-32℃下磁力搅拌1-1.5小时；10-15分钟内逐渐增加温度到40℃；之后每分钟增加5℃至沸点，煮沸3-5分钟，冷却至室温，离心，取上清，过滤收集滤液即得。本专利技术的第二个目的是提供上述培养基的制备方法，所述培养基A的制备方法为：将配方量的支原体肉汤基础、去离子水、葡萄糖、丙酮酸钠、1%的酚红、10%的醋酸铊溶液充分混匀，调pH至7.8，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50-55℃，加入配方量的灭活的马血清、酵母提取液、灭菌的青霉素水溶液、灭菌的L-半胱氨酸盐酸盐的水溶液、灭菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的水溶液，混匀后无菌条件下调整pH至7.7-7.8。作为优选，所述培养基B的制备方法为：将配方量的支原体肉汤基础、去离子水、丙酮酸钠、1%的酚红、10%的醋酸铊溶液充分混匀，调pH至7.8，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50-55℃，加入配方量的灭活的马血清、酵母提取液、灭菌的青霉素水溶液、灭菌的L-精氨酸盐酸盐的水溶液，混匀后无菌条件下调整pH至7.2-7.3。本专利技术的第三个目的是提供应用上述培养基培养鹅支原体的方法，将鹅支原体接种到培养基中，在37℃恒温下静置培养，得到扩大培养的鹅支原体。本专利技术对上述培养基的PH值和营养成分等进行了筛选和分析，通过PH值的升高或下降，观察培养基颜色的变化，可快速鉴别支原体的生长（其中A培养基随pH值降低变为橘黄色，B培养基随pH值升高变为深粉色）；通过添加醋酸铊、提高青霉素的浓度，可阻止环境中其他杂菌的生长，使培养基在2-8℃存储时间从1-2月延长为4-5月；通过添加新鲜酵母提取液和生长所需的氨基酸，能明显缩短鹅支原体生长时间，提高活菌滴度；经反复实验证实该培养基培养鹅支原体24小时即可生长，生长48小时的滴度可达103CCU/mL；而未添加之前36-48小时才能生长，生长72-80小时才能达到103CCU。本专利技术的培养基具有生长快速、含菌量高的特点，适用于鹅支原体的分离培养。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鹅支原体体外液体培养基，由培养基A和培养基B组成，所述培养基A为分解葡萄糖的支原体体外培养基，所述培养基B为分解精氨酸的支原体体外培养基，其特征在于：所述培养基A的配方为：支原体肉汤基础，去离子水，葡萄糖，丙酮酸钠，1%的酚红，10%的醋酸铊溶液，灭活的马血清，酵母提取液，青霉素，L‑半胱氨酸盐酸盐，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；所述培养基B的配方为：支原体肉汤基础，去离子水，丙酮酸钠，1%的酚红，10%的醋酸铊溶液，灭活的马血清，酵母提取液，青霉素，L‑精氨酸盐酸盐。
【技术特征摘要】
1.一种鹅支原体体外液体培养基，由培养基A和培养基B组成，所述培养基A为分解葡萄糖的支原体体外培养基，所述培养基B为分解精氨酸的支原体体外培养基，其特征在于：所述培养基A的配方为：支原体肉汤基础，去离子水，葡萄糖，丙酮酸钠，1%的酚红，10%的醋酸铊溶液，灭活的马血清，酵母提取液，青霉素，L-半胱氨酸盐酸盐，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；
所述培养基B的配方为：支原体肉汤基础，去离子水，丙酮酸钠，1%的酚红，10%的醋酸铊溶液，灭活的马血清，酵母提取液，青霉素，L-精氨酸盐酸盐。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基A的配方为：支原体肉汤基础18-23g/L，去离子水680-720mL/L，葡萄糖4-6g/L，丙酮酸钠1.5-3g/L，1%的酚红3-4mL/L，10%的醋酸铊溶液2-3.2mL/L，灭活的马血清150-180mL/L，酵母提取液40-55mL/L，青霉素80-100万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于：所述培养基A的配方为：支原体肉汤基础21g/L，去离子水700-720mL/L，葡萄糖5g/L，丙酮酸钠2g/L，1%的酚红3mL/L，10%的醋酸铊溶液2.6mL/L，灭活的马血清150mL/L，酵母提取液45mL/L，青霉素80万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基B的配方为：支原体肉汤基础18-23g/L，去离子水700-740mL/L，丙酮酸钠1-2g/L，1%的酚红1-1.5mL/L，10%的醋酸铊溶液2-3.2mL/L，灭活的马血清150-180mL/L，酵母提取液40-55mL...
【专利技术属性】
技术研发人员：宫晓炜，刘永生，郑福英，陈启伟，储岳峰，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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