本发明专利技术属于植物转化领域，具体涉及一种提高小麦幼胚出芽率的方法及其培养基配方，本发明专利技术提供了一种小麦幼胚胚性愈伤诱导培养基MSV4，可以提高小麦幼胚胚性愈伤的诱导率，其特征在于所述诱导培养基含有终浓度为0.027mM的甘氨酸，0.1~2.57 mM的谷氨酰胺，50~500mg/L的水解酪蛋白和0.5~52 mg/L 的Dicamba。本发明专利技术建立的高效小麦幼胚培育体系，为后续小麦功能基因组学的研究和小麦分子育种，具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物转化领域，具体涉及一种提高小麦幼胚出芽率的方法及其培养基配方。
技术介绍
小麦是最后一个转化成功的重要禾谷类粮食作物，一方面由于小麦属于六倍体作物，遗传背景复杂，基因组相对较大(约17Gb)，是玉米的7倍，水稻的40倍；另一方面，小麦遗传转化过程中DNA导入频率低且转化后再生能力不高，有较强的基因型依赖性。自1992年成功获得第一例转基因小麦以来，人们尝试利用多种转化方法和多种外植体转化小麦，转化方法包括农杆菌、基因枪、花粉管通道、超声波法、离子束注入法、激光微束穿刺法和PEG法等，外植体包括幼胚、成熟胚、花药愈伤组织和幼穗等，在降低转化的基因型依赖性、提高转化效率等方面取得了一定的进展，但普遍存在的问题是转化效率仍然很低，难以实现规模化。本专利技术对提高小麦幼胚出芽率的方法进行了探索，并建立了高效的小麦幼胚培育体系，为后续小麦功能基因组学的研究和小麦分子育种，具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种提高小麦幼胚胚性愈伤产生率的培养基配方和组织培养方法。本专利技术所提供的提高小麦幼胚胚性愈伤产生率的方法，在预培养阶段，可以有效的提高幼胚产生胚性愈伤的效率，本专利技术提供了一种小麦幼胚胚性愈伤诱导培养基MSV4，可以提高小麦幼胚胚性愈伤的诱导率，其特征在于所述诱导培养基含有终浓度为0.027mM的甘氨酸，0.1～2.57mM的谷氨酰胺，50～500mg/L的水解酪蛋白和0.5～52mg/L的Dicamba。在上述诱导培养基中，还包含MS大量元素、微量元素、铁盐和B5的维生素。更具体的，本专利技术提供了一种小麦幼胚胚性愈伤诱导培养基，所述诱导培养基的组成组分是：CaCl22.99mM，KNO318.79mM，NH4NO320.61mM，KH2PO41.25mM，MgSO41.50mM，MnSO41mM，ZnSO426～30μM，H3BO381～100μM，KI4.5～5μM，NaMoO41μM，CuSO40.1μM，CoCl60.1μM，FeSO4100μM，Na2-EDTA100μM，烟酸4.1～8μM，肌醇0.56mM，盐酸硫胺素0.3～30μM，盐酸吡哆醇2.4～4.9μM，甘氨酸0.027mM，谷氨酰胺0.1～2.57mM，水解酪蛋白50～500mg/L，Dicamba0.5～52mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8，phytagel4g/L。本专利技术还提供了一种上述诱导培养基的制备方法，包括以下步骤：按上述配方将各组分添加到MS基础培养基中，在高温灭菌完冷却后，再加入Dicamba2mg/L。更具体的，其中所述的高温灭菌的一般条件是121℃，20min。本专利技术还提供了一种提高小麦幼胚胚性愈伤率的组织培养方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：a)采集小麦授粉后的小麦幼胚；b)将小麦幼胚在含有终浓度为0.027mM的甘氨酸、0.1～2.57mM的谷氨酰胺、50～500mg/L的水解酪蛋白和0.5～52mg/L的Dicamba的诱导培养基上进行预培养。其中所述的小麦幼胚为小麦授粉后12-16天、直径为0.8-1.5mm的幼胚。在小麦授粉12-16天后，将小麦穗子上的未成熟种子放入灭菌三角瓶中加入75％乙醇摇洗1min，灭菌水洗三次；加入1％硝酸银，放入摇床中170rpm震荡15min，最后用灭菌水冲洗3-4次。再采集未成熟种子中的幼胚。更具体地，在预培养阶段，是将幼胚盾片向上的接种于培养基上，预培养的时间是6-8天。专利技术人在研究过程中发现，在小麦幼胚转化的预培养阶段，将幼胚接种于培养基上时可以有不同的放置方向，盾片向上或盾片向下，专利技术人通过对幼胚不同放置方向产生胚性愈伤的效率进行比较，结果发现，盾片向上产生胚性愈伤的比例为22％，而盾片向下产生胚性愈伤的比例为0，尤其说明在小麦幼胚转化的预培养阶段，将盾片向上放置在培养基上，可以有效的提高胚性愈伤的产生效率，从而提高小麦转化的效率。本专利技术所提供的组织培养方法，适用于所有小麦品种，所述小麦品种包括但不限于扬麦158、中国春、济麦22、京冬18、川农16、宁春4号、科农199和CB037。更具体地，在上述组织培养方法中，其中所述的MSV4诱导培养基的组成成分是：CaCl22.99mM，KNO318.79mM，NH4NO320.61mM，KH2PO41.25mM，MgSO41.50mM，MnSO41mM，ZnSO426～30μM，H3BO381～100μM，KI4.5～5μM，NaMoO41μM，CuSO40.1μM，CoCl60.1μM，FeSO4100μM，Na2-EDTA100μM，烟酸4.1～8μM，肌醇0.56mM，盐酸硫胺素0.3～30μM，盐酸吡哆醇2.4～4.9μM，甘氨酸0.027mM，谷氨酰胺0.1～2.57mM，水解酪蛋白50～500mg/L，Dicamba0.5～52mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8，phytagel4g/L。将三个小麦品种(科农199、CB037、扬麦158)用MSV4培养基预培养6-8天的幼胚的出芽率分别是57.4％、81.7％和44.1％。本专利技术使用现有技术中公开的诱导培养基MSV5进行幼胚培育，溶剂为水，MSV5的组成成分是：CaCl22.99mM，KNO318.79mM，NH4NO320.61mM，KH2PO41.25mM，MgSO41.50mM，MnSO41mM，ZnSO426μM，H3BO381μM，KI4.5μM，NaMoO41μM，CuSO40.1μM，CoCl60.1μM，FeSO4100μM，Na2-EDTA100μM，烟酸4.1μM，肌醇0.56mM，盐酸硫胺素0.3μM，盐酸吡哆醇2.4μM，L-谷氨酰胺2.57mM，L-脯氨酸0.65mM，L-天门冬酰胺0.38mM，蔗糖90g/L，pH5.8，phytagel4g/L,121℃，20min，灭菌后加入2,4-D0.5mg/L，AgNO310mg/L。以上各浓度均为相应物质在所述MSV5培养基中的终浓度。本专利技术将三个小麦品种(科农199、CB037、扬麦158)用MSV5培养基预培养6-8天的幼胚的出芽率分别是19.6％、25.4％和19.6％。说明本专利技术所提供的MSV4培养基可以更好的提高小麦幼胚的胚性愈伤率，从而提高小麦幼胚培育的出芽率。综合而言，本专利技术通过提供一种MSV4培养基，使小麦幼胚的胚性愈伤产生率明显提高，这对于利用基因工程途径和细胞工程途径改良优良小麦品种具有重要意义。附图说明图1是不同培养基和预培养时间的比较。A、B是小麦品种科农199，C、D是小麦品种CB037，E、F是小麦品种扬麦158。A、C、E是培养基MSV4上预培养6-8天，B、D、F是MSV5培养基上预培养2天。具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用化学试剂均购自SIGMA公司，小麦材料CB037从中国农业科学院作物科学研究所获得。实施例1.培养基的准备本专利技术中用到的培养基配方如下所示。诱导培养基MSV4：CaCl22.99mM，KNO318.79mM，NH4NO320.61mM，KH2PO41.25mM，MgSO41.50mM，MnSO41mM，ZnSO430μM，H3BO3100μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种小麦幼胚胚性愈伤的诱导培养基，其特征在于所述诱导培养基含有终浓度为0.027mM的甘氨酸， 0.1~2.57 mM的谷氨酰胺，50~500mg/L的水解酪蛋白和0.5~5 mg/L 的Dicamba。
【技术特征摘要】
1.一种小麦幼胚胚性愈伤的诱导培养基，其特征在于所述诱导培养基含有终浓度为0.027mM的甘氨酸，0.1~2.57mM的谷氨酰胺，50~500mg/L的水解酪蛋白和0.5~5mg/L的Dicamba。2.权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于所述诱导培养基还包含MS大量元素、微量元素、铁盐和B5的维生素。3.一种小麦幼胚胚性愈伤的诱导培养基，其特征在于所述诱导培养基的组成组分是：CaCl22.99mM，KNO318.79mM，NH4NO320.61mM，KH2PO41.25mM，MgSO41.50mM，MnSO41mM，ZnSO426~30μM，H3BO381~100μM，KI4.5~5μM，NaMoO41μM，CuSO40.1μM，CoCl60.1μM，FeSO4100μM，Na2-EDTA100μM，烟酸4.1~8μM，肌醇0.56mM，盐酸硫胺素0.3~30μM，盐酸吡哆醇2.4~4.9μM，甘氨酸0.027mM，谷氨酰胺0.1~2.57mM，水解酪蛋白50~500mg/L，Dicamba0.5~5mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8，phytagel4g/L。4.一种提高小麦幼胚胚性愈伤率的组织培养方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：a)采集小麦授粉后的小麦幼胚;b）将小麦幼胚在含有终浓度为0.027mM的甘氨酸、0.1~2.57mM的谷氨酰胺、50...
【专利技术属性】
技术研发人员：李健，王峥，马力耕，邓兴旺，
申请(专利权)人：未名兴旺系统作物设计前沿实验室北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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