雄性育性的保持方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种小麦育性恢复基因及其应用，属于植物生物技术领域，具体涉及一个隐性核雄性不育基因及其启动子的克隆，及其在杂交育种中的应用。本发明专利技术通过流式细胞术和高通量测序的方法，成功克隆了一个育性恢复基因

Maintaining method of male fertility and its application

The invention discloses a wheat fertility restorer gene and application thereof, which belongs to the field of plant biotechnology, in particular to a clone of Recessive Genic Male Sterility Gene and its promoter, and its application in hybrid breeding in. A fertility restorer gene was successfully cloned by flow cytometry and high-throughput sequencing

【技术实现步骤摘要】
雄性育性的保持方法及其应用
本专利技术属于植物生物
，具体涉及植物隐性核雄性不育基因的克隆，及其雄性不育系的繁殖方法和在杂交育种中的应用，更具体地涉及一个小麦隐性核雄性不育基因及其启动子的克隆，及其在杂交育种中的应用。技术背景杂种优势是生物界的普遍现象，杂交种育种是选育新品种的主要途径，是近代育种工作最重要方法。与水稻、玉米、高粱等相比，小麦杂种优势利用的研究相对滞后，近十年来其平均产量的增长也趋于停滞、甚至出现连续多年下滑的局面。小麦是自花授粉作物，小麦杂种优势利用的核心问题是高效生产小麦杂交种的技术体系，国内外大量科学家为此已做出巨大的努力，并取得一系列重要成果。综合近50年来的研究进展，小麦杂种优势利用研究主要集中于：核质互作雄性不育的利用(“三系法”)、化学杀雄技术的利用(“化杀法”)和光温敏核雄性不育的利用(“两系法”)。三系法由于不育系难以繁殖、恢复源较窄、细胞质副效应等原因，未能在生产上大面积应用。化杀法避开了恢复与保持间的相互关系，曾被认为是一种很有希望的小麦杂交制种新技术，但由于其在制种过程中稳定性差、制种成本高及环境污染等多方面原因，在实际生产上也难以推广利用。基于光温敏的两系法虽然具有制种成本低、恢复源广泛，较易获得优势组合等优点，但也面临着两大关键问题——环境因素的不稳定性对不育系育性的影响和利用光温敏特性所选育的小麦不育系十分有限。隐性核雄性不育突变体用于作物杂种优势利用，其不育性具有易被恢复而不易被保持的特性。与细胞质雄性不育杂交小麦体系相比，隐性核雄性不育突变体用于杂交小麦开发具有以下优点：1)不存在外源细胞质的负面影响，杂种F1优势强；2)父本系对杂种F1的育性恢复度高；3)不育系、保持系、父本系的育种亲本材料选择不受特定恢/保关系的限制，选材范围极广、种质资源利用率高，有利于选育高配合力的杂交种。但是，按照常规方法无法实现纯合核不育系种子的大量有效生产。因此，针对小麦杂种优势利用的现状，建立高效小麦雄性不育繁育新体系，是杂交小麦获得成功应用的最关键因素之一。小麦显性核雄性不育系由于其自身的遗传特点，既找不到完全的恢复系，也找不到完全的保持系，比如1972年在我国发现的太谷核不育系(即MS2)，因此只适用于常规育种轮回选择和回交育种手段，不能用作杂交小麦育种的亲本。而隐性核雄性不育材料与任何正常材料杂交，F1代均可育，任何育性正常的材料都是其恢复系，只要解决核不育性的标识和有效保持的问题，就能应用于新一代小麦杂交育种技术。小麦基因组巨大(17Gb)，约是人类的5倍，水稻的40倍，拟南芥的100倍；组成极其复杂，由A、B、D三个具有部分同源关系的染色体组组成，每个染色体组由7对染色体构成，共有21对染色体，是典型的异源六倍体(ZhangZB,etal.,2002)，并且约75％是简单重复序列(RachelB,etal.,2012；IWGSC,2014)。近年来，虽然小麦及其近缘种的基因组测序工作取得了很大进展，但截至目前，仍然没有完整的参考基因组序列公布(VogelJP,etal.,2010；TheInternationalBarleyGenomeSequencingConsortium,2012；RachelB,etal.,2012；LingHQ,etal.,2013；JiaJ,etal.,2013；IWGSC,2014)。如此复杂的基因组使得小麦功能基因的研究工作异常困难，目前为止国际范围内小麦突变体成功克隆基因的例子只有寥寥几个。本专利技术通过流式细胞术和高通量测序的方法，成功克隆了育性恢复基因FRG1，该基因可以完全恢复兰州核雄性不育突变体或其等位突变体的雄性育性，为构建新型小麦杂交育种技术体系奠定了基础。同时，为解决小麦现有的“三系”和两系”杂交技术所存在不育系育性不稳定、杂交品种资源受局限、制种技术复杂、制种成本高等技术瓶颈问题，提供了更多的可能性。本专利技术所提供的基因及不育系的繁殖和保持方法，对小麦杂交育种工作具有重要的意义和应用价值。
技术实现思路
本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本专利技术所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。本专利技术提供了一个育性恢复基因FRG1(FertilityRestorationgene1)，所述育性恢复基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：(a)如SEQIDNO：2、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27或35所示的核苷酸序列；(b)其编码氨基酸序列如SEQIDNO：4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的核苷酸序列；(c)在严谨条件下能够与(a)或(b)中所述序列的DNA杂交的DNA序列；或(d)与(a)-(c)所述序列有至少80％(优选为至少85％)序列相似性，且具有育性恢复功能的DNA序列；或(e)与(a)-(d)之任一所述序列互补的DNA序列。本领域技术人员应该知晓，本专利技术所述的育性恢复基因还包括与FRG1基因的核苷酸序列或蛋白序列高度同源，并且具有同样的育性调控或恢复功能的同源基因序列。所述高度同源且具有育性调控功能的的同源基因包括在严谨条件下能够与具有SEQIDNO：2、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27或35所示序列的DNA杂交的DNA序列。或是其编码的氨基酸序列与SEQIDNO:4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的蛋白氨基酸序列具有85％以上相似性的核苷酸序列。本文中使用的“严谨条件”是公知的，包括诸如在含400mMNaCl、40mMPIPES(pH6.4)和1mMEDTA的杂交液中于53℃-60℃杂交12-16小时，然后在62℃-68℃下用含0.5×SSC、和0.1％SDS的洗涤液洗涤15-60分钟。上述同源基因还包括与SEQIDNO：2、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27或35所示序列的全长有至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％序列相似性，且具有育性调控功能的DNA序列，可以从任何植物中分离获得。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法、Needleman-Wunsch全局比对法、Smith-Waterman局部比对法、Pearson和Lipman相似性搜索法、Karlin和Altschul的算法。这对于本领域技术人员来说是公知的。本专利技术还提供了一种表达盒，所述表达盒含有本专利技术所公开的育性恢复基因的DNA序列，所述育性恢复基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：(a)如SEQIDNO：2、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27或35所示的核苷酸序列；(b)其编码氨基酸序列如SEQIDNO:4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的核苷酸序列；(c)在严谨条件下能够与(a)或(b)中所述序列的DNA杂交的DNA序列；或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种育性恢复基因，其特征在于所述育性恢复基因

【技术特征摘要】
2016.07.25 CN 20161058876841.一种育性恢复基因，其特征在于所述育性恢复基因FRG1的核苷酸序列选自下列组的序列之一：(a)如SEQIDNO：5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26或27所示的核苷酸序列；(b)其编码氨基酸序列如SEQIDNO:7、10、13、16、19、22、25或28所示的核苷酸序列；(c)在严谨条件下能够与（a）或（b）中所述序列的DNA杂交的DNA序列；或(d)与（a）-（c）所述序列有至少80%（优选为至少85%）序列相似性，且具有育性恢复功能的DNA序列；或(e)与（a）-（d）之任一所述序列互补的DNA序列。2.一种表达盒、表达载体或工程菌，其特征在于所述表达盒、表达载体或工程菌包含权利要求1所述的育性恢复基因。3.一种育性恢复基因、表达盒、表达载体或工程菌在调控植物育性中的应用，其特征在于所述育性恢复基因、表达盒、表达载体、工程菌含有如下所示的核苷酸序列之一：(a)如SEQIDNO：5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26或27所示的核苷酸序列；(b)其编码氨基酸序列如SEQIDNO:7、10、13、16、19、22、25或28所示的核苷酸序列；(c)在严谨条件下能够与（a）或（b）中所述序列的DNA杂交的DNA序列；或(d)与（a）-（c）所述序列有至少80%（优选为至少85%）序列相似性，且具有育性恢复功能的DNA序列；或(e)与（a）-（d）之任一所述序列互补的DNA序列。4.一种调控植物育性的方法，所述方法通过过表达、抑制或突变植株中的育性恢复基因，影响其表达水平，进而调控植物育性，其特征在于：所述育性恢复基因FRG1的核苷酸序列选自下列组的序列之一：(a)如SEQIDNO：5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26或27所示的核苷酸序列；(b)其编码氨基酸序列如SEQIDNO:7、10、13、16、19、22、25或28所示的核苷酸序列；(c)在严谨条件下能够与（a）或（b）中所述序列的DNA杂交的DNA序列；或(d)与（a）-（c）所述序列有至少80%（优选为至少85%）序列相似性，且具有育性恢复功能的DNA序列；或(e)与（a）-（d）之任一所述序列互补的DNA序列。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的突变包括在育性恢复基因的核苷酸序列上进行取代、缺失或添加一个或多个核苷酸。6.根据权利要求4-5之任一所述的方法，其中所述的“突变”包括但不限于以下方法，如用物理或化学的方法所导致的基因突变，化学方法包括用EMS等诱变剂处理所导致的诱变，或是通过RNAi等基因沉默手段或者通过基因编辑等方法，所述基因定点突变的方法包括但不限于ZFN、TALEN、和/或CRISPR/Cas9等基因编辑方法。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法包括用FRG1基因的核苷酸序列互补由FRG1基因突变所导致的雄性不育表型，使frg1雄性不育系恢复成可育。8.权利要求4-7之任一所述的方法在调控植物育性中的应用。9.一种雄性不育系的生产或繁殖方法，所述方法包括以下步骤：(a)向frg1雄性不育系中转入下述载体，以获得含有下述载体的保持系，所述载体包含：育性恢复基因FRG1，所述育性恢复基因FRG1可以恢复frg1雄性不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表达时，会干扰植株中含有该花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，从而使得所述植株中产生的可育雄性配子都是不含所述载体的；和筛选基因，所述筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣；和(b)将转入上述载体后形成的保持系植株自交，同时产生不含载体的frg1雄性不育系种子和含载体的保持系种子；或是用保持系植株的花粉给frg1不育系植株授粉上，使frg1不育系授粉繁殖出frg1不育系种子。10.根据权利要求9所述的生产或繁殖方法，其中所述的育性恢复基因FRG1的核苷酸序列选自下列组的序列之一：(a)如SEQIDNO：5、6、8...

【专利技术属性】
技术研发人员：马力耕，王峥，李健，何航，陈少霞，邓兴旺，
申请(专利权)人：未名兴旺系统作物设计前沿实验室北京有限公司，北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11