一种基于CRISPR‑Cas9系统的基因编辑载体及其应用技术方案

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR‑Cas9系统的基因组编辑载体及其应用，属于植物基因工程领域，具体涉及一种基于CRISPR‑Cas9系统的小麦基因组编辑载体及其应用。本发明专利技术通过比较CRISPR‑Cas9系统的转化载体，采用不同Cas9启动子、不同sgRNA启动子和不同sgRNA序列结构时的基因编辑效率，获得了在小麦中编辑效率更高的CRISPR‑Cas9转化载体。此优化载体显著提高了小麦作物利用CRISPR‑Cas9进行基因编辑的效率，克服了小麦等作物中CRISPR‑Cas9载体转化后突变率低、获得CRISPR‑Cas9转基因突变株系难的问题，节约了转化时间，减少了转化成本，对CRISPR‑Cas9基因编辑系统在作物中的推广应用奠定了更好的基础。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑载体及其应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas9系统的小麦基因组编辑载体及其应用。
技术介绍
自上世纪80年代末，基于人工核酸内切酶的基因修饰技术开始发展，目前主要包括：第一代人工核酸内切酶锌指核酸酶(ZFN)技术、第二代人工核酸内切酶转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)技术、第三代人工核酸内切酶CRISPR-Cas9核酸酶技术。ZFN技术特异识别能力差，容易出现脱靶现象，引起其他目的基因突变和染色体畸变。此外，ZFN的设计筛选耗时费力，成本高，因此限制了其更加广泛的应用。TALEN相对ZFN技术脱靶几率小，细胞毒性小，一度得到广泛的应用。作为新兴的基因编辑技术，CRISPR-Cas9具有无可比拟的优点:1.靶向精确性更高。RNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9才会对DNA进行剪切。2.可实现对靶基因多个位点同时敲除。3.实验周期短，效率高。4.靶点多，无物种限制。小麦是由A、B、D三套基因组组成的异源六倍体，基因的平均拷贝数为2.8个，其中接近一半的基因(46％)有3-4个拷贝，12％的基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于基因组编辑的载体，所述载体含有一个sgRNA4TmC+5结构和一个Cas9基因，其特征在于所述sgRNA4TmC+5结构的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于基因组编辑的载体，所述载体含有一个sgRNA4TmC+5结构和一个Cas9基因，其特征在于所述sgRNA4TmC+5结构的核苷酸序列如SEQIDNO:20所示。2.根据权利要求1所述的载体，其中所述的sgRNA4TmC+5结构前还可操作性的连接有一个启动子，所述启动子选自由TaU3p、OsU3p、TaU6或OsU6bp等启动子构成的组之一。3.根据权利要求1或2所述的载体，其中所述的Cas9基因的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。4.根据权利要求3所述的载体，其中所述的Cas9基因的前面可操作性的连接有一个启动子，所述启动子选自由Ubi或2*35S启动子构成的组之一。5.一种基因组编辑方法，所述方法通过CRISPR-Cas9系统完成，其特征在于所述CRISPR-Cas9系统的载体中含有一个sgRNA4TmC+5结构和一个Cas9基因，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李健，王峥，马力耕，邓兴旺，
申请(专利权)人：未名兴旺系统作物设计前沿实验室北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11