一种简便高效的基因编辑方法技术

本发明专利技术公开了一种简便高效的基因编辑方法。本发明专利技术方法利用复制过程中基因组高频自发断裂和chi位点促进同源重组的原理，设计合成或构建带有并行重复序列和双向筛选标记基因的同源重组核酸片段，该片段在引入基因组后通过分子内同源重组消除引入的外源标记基因。相对于需要进行两次转化的传统基因编辑方法，本发明专利技术方法仅需要一次转化，并且可有效地提高负筛选的效率，最高可达到50%。本发明专利技术的方法可以实现基因的删除、替换、插入等基因编辑操作。

【技术实现步骤摘要】
一种简便高效的基因编辑方法
本专利技术属于基因工程领域，具体地涉及一种基因编辑方法。
技术介绍
近年来，随着第二代和第三代高通量测序技术的发展，功能基因组学和合成生物学的迅速发展迫切需要一种快速、无痕、高效的基因编辑工具，实现对基因组的定向编辑改造。模式微生物例如酵母菌、大肠杆菌等的无痕编辑技术近年来受到重视(Birdetal.,High-efficiencycounterselectionrecombineeringforsite-directedmutagenesisinbacterialartificialchromosomes.Naturemethods,2012.9(1):p.103-109)，所开发的无痕编辑工具丰富多样。例如在酵母菌的双向筛选标记基因URA3的上游引入酶切位点提高无痕编辑的效率(Noskov,etal.,Tandemrepeatcoupledwithendonucleasecleavage(TREC):aseamlessmodificationtoolforgenomeengineeringinyeast.Nucleicacidsresearch,2010.38(8):p.2570-2576)，在大肠杆菌开发多种双向筛选标记基因galK,thyA,tolC,tetA-sacB(Warmingetal.,SimpleandhighlyefficientBACrecombineeringusinggalKselection.Nucleicacidsresearch,2005.33(4):p.e36；Wongetal.,EfficientandseamlessDNArecombineeringusingathymidylatesynthaseAselectionsysteminEscherichiacoli.Nucleicacidsresearch,2005.33(6):p.e59；Greggetal.,RationaloptimizationoftolCasapowerfuldualselectablemarkerforgenomeengineering.Nucleicacidsresearch,2014.DOI:10.1093/nar/gkt1374；Lietal.,PositiveandnegativeselectionusingthetetA-sacBcassette:recombineeringandP1transductioninEscherichiacoli.Nucleicacidsresearch,2013.41(22):p.e204)。但是，到目前为止基因编辑技术的难点，即双向筛选系统中标记基因的高效删除，仍未有效解决。出于转基因的安全性及无痕编辑等要求，通常需要在完成所需的基因编辑后删除标记基因。传统的双向筛选标记基因的删除首先通过将含有插入位点上下游同源区的单链或双链核酸片段转化进入细胞，然后通过同源重组替换基因组上的抗性标记基因，最后通过在培养基中加入负筛底物完成对重组细胞的富集，以挑选出去除筛选标记基因，获得无痕编辑的细胞。因此，传统的基因编辑技术需要两次转化，第一次转化用于将带有目的基因和标记基因的核酸片段转入细胞进行同源重组，同源重组后目的基因和标记基因进入靶基因组；第二次转化用于删除标记基因，即将含有插入位点上下游同源区的核酸片段转入细胞，通过同源重组替换基因组上的抗性标记基因。此外，用这种方法删除标记基因的效率往往很低。基因编辑技术中用于筛选重组子的双向筛选系统包含正筛选和负筛选，正筛选一般通过抗生素抗性标记基因赋予重组子对抗生素的抗性或通过营养缺陷型基因赋予在相应选择缺陷型培养基生长的特性来实现，负筛选一般利用某些基因赋予重组子对某些物质的敏感性来实现，例如利用sacB-neo融合基因来进行正/负筛选，neo(卡那霉素)抗性用于正筛选，而由于sacB基因的表达而产生的蔗糖毒性用于负筛选(Warmingetal.,SimpleandhighlyefficientBACrecombineeringusinggalKselection.Nucleicacidsresearch,2005.33(4):p.e36)。双向筛选也可通过一个双向筛选标记基因来实现，例如tolC基因既可用于正筛选又可用于负筛选(Greggetal.,RationaloptimizationoftolCasapowerfuldualselectablemarkerforgenomeengineering.Nucleicacidsresearch,2014.DOI:10.1093/nar/gkt1374)。负筛的成功率往往极低甚至常常失败。这主要是由于负筛选的致死过程需要有毒物质的生产与积累，在积累过程中细胞容易发生自发突变产生对有毒物质的抗性，使得细胞能够在保有负筛基因的情况下生存。不仅如此，负筛前的转化过程也常常引入对负筛物质不敏感的外源细胞而导致负筛过程的失败。因此，本领域需要一种能够快速、高效地进行基因编辑的方法。
技术实现思路
针对传统基因编辑方法的上述及其他缺陷，本专利技术提供一种基因编辑方法，包括以下步骤：a.提供靶细胞，所述靶细胞包含带有待修饰位点的靶核酸；b.用包含所述待修饰位点的上下游同源序列、目的基因、并行重复序列和双向筛选标记基因的核酸片段转化所述靶细胞，以使所述核酸片段和靶核酸发生同源重组，从而在所述待修饰位点产生所需要的基因编辑；c.进行正筛选以筛选出在靶核酸上整合了目的基因和双向筛选标记基因的重组子细胞；d.允许所述核酸片段上的并行重复序列和待修饰位点的上游或下游的相应并行重复序列发生同源重组，以删除标记基因；e.进行负筛选以富集删除了双向筛选标记基因的重组子细胞。一种优选实施方式中，上述步骤b中核酸片段上的并行重复序列为靶核酸上待修饰位点上游或下游的原始序列。另一种优选的实施方式中，步骤b中核酸片段上的并行重复序列与靶核酸上紧邻修饰位点的上游或下游的序列同源，以实现无痕编辑。另外一种实施方式中，步骤d中在不含正负筛选物质的培养基中培养步骤c筛选出的重组子细胞以允许所述核酸片段上的并行重复序列和待修饰位点的上游或下游的相应并行重复序列发生同源重组，从而删除标记基因。另外一种实施方式中，步骤b中的双向筛选标记基因包含一个或多个Chi位点以提高双向筛选标记基因删除的效率。优选实施方式中，可以在不影响双向筛选标记基因功能的前提下，将Chi位点引入到双向筛选标记基因的任意一个或多个位点。所述Chi位点可以是正向的或反向的，多个Chi位点之间可以是连续的或不连续的。在不同类型的基因组中可使用不同的Chi位点，且在同一类型的基因组中可使用不同强度的Chi位点序列。一种实施方式中，本专利技术方法用于原核细胞或真核细胞基因组任意位置基因的编辑，即靶核酸为原核细胞或真核细胞的基因组。另外一种实施方式中，本专利技术方法用于在质粒或人工染色体(BAC)上进行基因编辑，即靶核酸为质粒或人工染色体。附图说明附图1：基因编辑的三种主要方式。附图2：并行重复序列辅助基因编辑的原理示意图。附图3：含有Chi位点的双向筛选标记基因示意图。附图4：并行重复序列和Chi位点辅助基因编辑的原理示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因编辑方法，包括以下步骤：a.提供靶细胞，所述靶细胞包含带有待修饰位点的靶核酸；b.用包含所述待修饰位点的上下游同源序列、目的基因、并行重复序列和双向筛选标记基因的核酸片段转化所述靶细胞，以使所述核酸片段和靶核酸发生同源重组，从而在所述待修饰位点产生所需要的基因编辑；c.进行正筛选以筛选出在靶核酸上整合了目的基因和双向筛选标记基因的重组子细胞；d.允许所述核酸片段上的并行重复序列和待修饰位点的上游或下游的相应并行重复序列发生同源重组，以删除标记基因；e.进行负筛选以富集删除了双向筛选标记基因的重组子细胞。

【技术特征摘要】
1.一种基因编辑方法，包括以下步骤：a.提供靶细胞，所述靶细胞包含带有待修饰位点的靶核酸；b.用包含所述待修饰位点的上下游同源序列、目的基因、并行重复序列和双向筛选标记基因的核酸片段转化所述靶细胞，以使所述核酸片段和靶核酸发生同源重组，所述核酸片段整合到靶核酸上；c.进行正筛选以筛选出在靶核酸上整合了目的基因和双向筛选标记基因的重组子细胞；d.允许所述核酸片段上的并行重复序列和待修饰位点的上游或下游的相应并行重复序列发生同源重组，以删除标记基因；e.进行负筛选以富集删除了双向筛选标记基因的重组子细胞；步骤b中核酸片段上的并行重复序列为靶核酸上待修饰位点上游或下游的原始序列，或者，步骤b中核酸片段上的并行重复序列与靶核酸上紧邻待修饰位点的上游或下游的序列同源，以实现无痕编辑；步骤b中核酸片段上双向筛选标记基因为既可以进行正筛选又可以进行负筛选的基因；其中与待修饰位点的上下游序列同源的序列位于该核酸片段的两端，用于与靶核酸同源重组；所述并行重复序列一个位于待修饰位点的上游或下游，一个在核酸片段上，在发生所述步骤b中的同源重组之后，靶核酸上含有两个并行重复序...

【专利技术属性】
技术研发人员：马延和，刘谊兰，邢建民，王钦宏，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12