羊驼TGF-β1-3′UTR双荧光素酶报告基因载体及其构建和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种羊驼TGF-β1-3′UTR双荧光素酶报告基因载体及其构建和应用，所述报告基因载体是将SEQ ID No.3所示的核苷酸序列插入到载体pmirGLODual-LuciferasemiRNATargetExpression的SacI和XbaI位点之间构建而成，用于检测miR663对TGF-β1基因的调控作用，为后续在细胞水平和动物水平上研究miR-663对候选靶基因TGF-β1生物学功能的验证和调控机制奠定基础，同时，也可以对靶基因是TGF-β1的microRNA的功能进行研究。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种羊驼TGF-β1-3′UTR双荧光素酶报告基因载体及其构建和应用，所述报告基因载体是将SEQ?ID?No.3所示的核苷酸序列插入到载体pmirGLODual-LuciferasemiRNATargetExpression的SacI和XbaI位点之间构建而成，用于检测miR663对TGF-β1基因的调控作用，为后续在细胞水平和动物水平上研究miR-663对候选靶基因TGF-β1生物学功能的验证和调控机制奠定基础，同时，也可以对靶基因是TGF-β1的microRNA的功能进行研究。【专利说明】羊驼TGF-β 1-3’ UTR双荧光素酶报告基因载体及其构建和应用
本专利技术属于基因工程
，涉及一种基于羊驼TGF-β I基因的双荧光素酶报告基因载体，以及该载体的构建方法和应用。
技术介绍
转化生长因子-β(transforming growth factor-β , TGF-β )是细胞增殖和分化的重要调节蛋白之一，在细胞外基质形成、胚胎发育、创伤愈合及肿瘤发生等过程中起重要作用。在哺乳动物细胞中存在TGF-β 1、TGF-0 2和TGF-0 3三种亚型，其中以TGF-β I含量最高，几乎参与了所有的病理和生理过程。TGF-β I在细胞生长和分化、促进成纤维细胞的生长和抑制上皮角朊细胞的生长等方面也起着重要的作用。MicroRNA (即miRNA)是由18-25个核苷酸组成的一类内源性、短序列非编码单链RNA,它由DNA转录产生，不翻译蛋白质，通过和mRNA 3’ UTR区结合来调控目标基因的表达。miRNA主要是通过5’端被称为种子序列(Seed Sequence)的7nt序列与位于革EmRNA 3’UTR的miRNA调控兀件(miRNA Regulatory Element, MRE)相互作用以识别革E mRNA。作为一种转录后调控小分子RNA，在动物中主要通过与靶mRNA的3’ UTR区特异性互补配对，抑制靶mRNA翻译或引起靶mRNA的降解，从而参与调控细胞分化、组织发育、肿瘤发生发展等多种生命过程。miRNA作为转录后基因调控的一种方式，在生物体内形成一个调控网络，由于miRNA调控涉及的方便广，调控控作用明显，本身序列短，便于操作和研究，越来越受到人们对其生物学功能研究的重视。miR-663在细胞的凋亡、免疫及肿瘤抑制中发挥着重要的作用，比如miR-663的甲基化与胃癌和乳腺癌的发生相关。而TGF-β I是生物信息学软件预测的miR-663的靶基因之一 O
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种羊驼TGF- β 1-3’ UTR双荧光素酶报告基因载体。本专利技术的第二个目的是提供该羊驼TGF-β 1-3’ UTR双荧光素酶报告基因载体的构建方法。本专利技术的第三个目的是提供上述TGF-β 1-3’UTR双荧光素酶报告基因载体的应用。本专利技术通过基因工程技术克隆并且构建了羊驼TGF-β 1-3’UTR双荧光素酶报告基因载体，本专利技术所述的羊驼TGF-β 1-3’UTR双荧光素酶报告基因载体包含有双荧光素酶报告基因载体，以及SEQ ID N0.3所示核苷酸序列的基因片段，所述核苷酸序列位于羊驼TGF-β I基因的3’UTR区。 其中，优选的双荧光素酶报告基因载体为pmirGLO Dual-Luciferase miRNATarget Expression,由美国 Promega 公司提供。具体而言，本专利技术的羊驼TGF-β 1-3’UTR双荧光素酶报告基因载体是通过下述方法构建而成的。根据生物信息学软件Targetscan (http://www.targetscan.0rg/)、RNAhybrid(http://bibiserv.techfak.un1-bielefeld.de/rnahybrid/)和 RNA22 (http://cbcsrv.watson.1bm.com/rna22.html),在线预测 miR-663 与 TGF-β 1-3’UTR 可能的相互结合的革巴位点。通过对GenBank中登录的人、小鼠、牛等哺乳动物的TGF-β 1基因序列进行同源性比较，选择保守性高的编码区，以牛基因序列(登录号:ΝΜ_001166068)为模板，用primer5软件设计羊驼TGF-β I基因编码区引物，并在上游引物中加入酶切位点I的序列，下游引物中加入酶切位点油a I的序列，设计出如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的特异的TGF-β 1-3’UTR 引物。TGF-β 1-3’ UTR-5ac 1-PF:5’ CGAGCTCCCCAAGGTGGAGCAG3’。TGF-β 1-3’ VTR-1ba 1-PR:5’ GCTCTAGATGTCCTTAAATACAG3’。以TRizol法提取羊驼黑色素细胞总RNA，用上述特异TGF-β 1_3’UTR引物扩增，得到具有SEQ ID N0.3所示核苷酸序列的TGF- β 1_3’ UTR基因片段，利用PCR产物纯化试剂盒对得到的TGF-β 1-3’ UTR片段进行回收。用Sac I和油al限制性内切酶酶切回收的TGF-β 1_3’ UTR片段，fee I和油al限制性内切酶酶切 pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression 载体，将扩增获得的羊驼TGF- β 1-3’ UTR基因片段插入双荧光素酶报告基因载体pmirGLO Dual-LuciferasemiRNA Target Expression的fee I和油a I酶切位点，构建羊驼TGF-β 1-3’UTR双荧光素酶报告基因载体，经酶切验证和测序鉴定后，命名为pmirGLO-TGF-β 1-3' UTR0本专利技术构建的羊驼TGF-β 1-3’UTR双荧光素酶报告基因载体可用于检测miR663对TGF-β I基因的调控作用，具体的，可用于在细胞水平和动物水平上研究miR-663对候选靶基因TGF-β I的生物学功能和调控机制。以本专利技术构建的pmirGLO-TGF-β 1-3’ UTR质粒载体进行检测验证，证明miR-663能够直接靶向TGF-β I基因的3’UTR，并对该基因起到负调控作用。进而，本专利技术构建的羊驼TGF-β 1-3’UTR双荧光素酶报告基因载体还可用于其他靶基因是TGF-β I的microRNA的功能研究。【专利附图】【附图说明】图1为羊驼黑色素细胞RNA的电泳图。图2为PCR扩增羊驼TGF-β 1-3’ UTR基因的电泳图。图3为PCR检测pmirGLO-TGF-β 1-3’UTR质粒载体的电泳图(a)及双酶切检测pmirGLO-TGF- β 1-3’ UTR质粒载体的电泳图(b)。图4为pmirGLO-TGF-β 1-3’ UTR质粒载体的结构图。【具体实施方式】下面结合附图对本专利技术提供的【具体实施方式】作详细说明。实施例1:羊驼TGF- β 1-3’ UTR双荧光素酶报告基因载体的构建。一、材料。1、质粒。pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression载体(简写为pmirGLO),购自美国Promega公司。2、试剂。Trizol R本文档来自技高网...

【技术保护点】
羊驼TGF‑β1‑3'UTR双荧光素酶报告基因载体，所述羊驼TGF‑β1‑3'UTR双荧光素酶报告基因载体含有双荧光素酶报告基因载体和SEQ ID No.3所示核苷酸序列的基因片段，所述核苷酸序列位于羊驼TGF‑β1基因的3'UTR区。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：贾小云，贺立恒，金雷皓，丁娜，范瑞文，杨珊珊，刘慧，沈洁，李芳，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：山西;14