一种新型线粒体基因组编辑工具制造技术

本发明专利技术公开了一种新型线粒体基因组编辑工具，属于基因组工程领域。本发明专利技术构建的mtCRISPR/Cas9系统主要包括两部分：进入线粒体的gRNA和定位于线粒体的Cas9核酸酶。其中，本发明专利技术构建的mt-gRNA有两种：1、由RNA线粒体定位引导序列、靶向目标序列和gRNA骨架序列组成；2、由RNA线粒体定位引导序列、线粒体编码的任意一种tRNA序列或其它额外间隔序列、靶向目标序列和gRNA骨架序列组成。mt-gRNA与mtCas9核酸酶结合后，作用于线粒体基因组，靶向断裂目标序列。此外，第二种mt-gRNA作用效率高于第一种。经验证，本发明专利技术构建的mtCRISPR/Cas9系统作用效率高、特异性强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因组工程领域，具体地说，涉及一种新型线粒体基因组编辑工具。
技术介绍
随着测序技术的不断发展，我们从中获得了越来越多的遗传信息。但如此庞大的信息又该如何应用？研究人员试图通过对特定靶向基因的破坏或敲除，来研究它们的相关功能，而实现这一目的的技术称为基因组编辑技术。此外，该技术还可应用于疾病的治疗和预防。目前，常用的基因组编辑技术主要包括以下三种：锌指蛋白技术(ZincFingerProteins，ZFPs)、转录激活因子样效应因子(Transcriptionactivator-likeeffectors，TALEs)技术、CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)技术。它们的大致原理都是通过对靶向DNA造成双链断裂(Doublestrandbreaks，DSBs)，进而引发细胞内固有的非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)或同源重组(homologousrecombination，HR)两种修复机制对断裂处进行修复。其中，易出错的NHEJ可以在DSBs处引入插入或缺失突变，这种突变不可人为控制。另一种修复机制HR，通过提供的单链或双链寡核苷酸模板对DSBs处进行精确修复，可人为控制。三种技术在作用机制与具体操作方式上又有所不同：锌指核酸酶(zinc-fingernuclease，ZFN)与转录激活子样效应因子核酸酶(tran-scriptionactivator-likeeffectornulease，TALEN)这两种人工核酸内切酶，都是通过DNA识别域与非特异性核酸内切酶FokI融合而成。其中，ZFN的锌指模块识别三联体碱基，序列识别上灵活性小、设计成本昂贵等问题都限制了它的发展。随后出现的TALEN在结构上较之ZFN更加优化，其DNA结合域中的各单元与靶向DNA序列一一对应，组装更为简单，特异性也更高，并于2012年被《Science》评为年度十大科技突破之一。2013年，一种源自细菌适应性免疫系统，由RNA介导Cas9蛋白剪切的全新基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统出现，在全球刮起了一阵CRISPR旋风，并被《Science》评为2013年度十大科技突破之一。较之ZFN、TALEN，CRISPR/Cas9系统在构建上更为简单，且成本低、作用效率高，极易广泛普及。经过近两年的发展，现已成功用于细菌、酵母、线虫以及多种模式动物、模式植物中，同时区别于ZFN、TALEN，成功的实现了对RNA的剪切编辑。作为新型的基因组编辑技术，为靶向突变目的基因，研究靶向基因间的相互作用，以及人类遗传疾病的最终治疗提供了强大的技术支持。目前来自化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)，经人工改造后的CRISPR/Cas9系统应用最广泛。其作用机制如下：首先，gRNA与Cas9蛋白形成的复合物在间隔序列(spacer)的指导下，与靶向序列结合。间隔序列一般为20bp，靶向DNA与之同源的序列称为原型间隔区(protospacer)。紧邻原型间隔区的下游，存在一小段序列，即原型间隔序列相邻基序(Protospaceradiacentmotifs，PAM)。PAM一般为2-5个碱基，且来自不同物种的CRISPR/Cas系统，其PAM不同。化脓链球菌中的PAM为NGG，N为任意碱基。因此，CRISPR/Cas9系统的特异性由20bp的原型间隔区和3bp的PAM共同决定。接着，识别靶向序列后，通过Cas9核酸酶进行剪切。Cas9蛋白存在两个核酸功能域，即RuvC-like和HNH。RuvC-like结构域剪切原型间隔区所在单链，即非互补链(Non-complementary)，作用位置为PAM上游3-8nt处。而HNH结构域剪切另一条单链，即互补链(complementary)，作用位置为PAM上游3nt处。两个结构域共同作用，在靶向位置处产生DSBs，进而引发细胞内的固有修复机制(NHEJ、HR)，对DNA损伤部分进行修复，从而引入突变(如图1所示)。线粒体是存在于大多数真核生物(包括植物、动物、真菌和原生生物)细胞中的细胞器，有“细胞中的能量工厂”之称。它主要通过氧化磷酸化以三羧酸循环腺苷(ATP)的形式为细胞活动提供能量。同时，还参与诸如铁硫簇的生物合成、钙稳态调节、细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并且拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。线粒体基因组，又称线粒体DNA(mtDNA)。长度一般为几万至数十万碱基对，人类mtDNA为16,569bps，共编码2个rRNA、13个mRNA、22个tRNA。基因排列紧凑，除与mtDNA复制及转录有关的一小段区域外，无内含子序列。mtDNA表现为母系遗传，突变率高，是细胞核内DNA的10倍左右。且mtDNA突变是导致人类线粒体遗传病及衰老性疾病的重要原因。研究表明，它与衰老及神经退行性病变如阿尔茨海默症、帕金森氏病等老年化疾病有关，同时也与肿瘤的形成密切相关。截至目前，已鉴定出超过500多个致病性突变来自mtDNA。而因缺乏对mtDNA相关序列的精确改造能力，现在对于这类疾病的治疗仍无有效手段。本专利技术，是继MichalMinczuk等将ZFN运用于mtDNA编辑(MichalMinczuketal.，2006)及SandraRBacman等将TALEN首次作用于mtDNA(SandraRBacmanetal.，2013)后，基于人工改造的CRISPR/Cas9系统的一种新型线粒体基因组编辑工具。迄今为止，国内外还未有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种高效、精确的线粒体基因组编辑工具。本专利技术基于对CRISPR/Cas9系统的改造，进而实现了对线粒体靶向基因的高效、精确编辑。该系统主要包括两部分：进入线粒体的向导RNA(mt-guideRNA，mt-gRNA)和定位于线粒体的Cas9核酸酶(mitoCas9，mtCas9)。所述进入线粒体的向导RNA包括以下两种：1、由RNA线粒体定位引导序列、靶向目标序列(Targetsequence)和gRNA骨架(gRNAscaffold)序列三部分组成的RNA(如图2A所示)；2、由RNA线粒体定位引导序列、线粒体编码的任意一种tRNA序列(GengWangetal.，2012)或其它额外间隔序列、靶向目标序列和gRNA骨架序列四部分组成的RNA(如图2B、2C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型线粒体基因组编辑工具，其特征在于，基于对CRISPR/Cas9系统改造而成，该系统可跨膜进入线粒体基质内，对线粒体中的DNA或者RNA进行加工，该系统主要包括两部分：进入线粒体的向导RNA(mt‑guide RNA，mt‑gRNA)和定位于线粒体的Cas9核酸酶(mito Cas9，mtCas9)，即独特的mtCRISPR/Cas9系统。

【技术特征摘要】
1.一种新型线粒体基因组编辑工具，其特征在于，基于对CRISPR/Cas9系统改造而成，该系统可跨膜进入线粒体基质内，对线粒体中的DNA或者RNA进行加工，该系统主要包括两部分：进入线粒体的向导RNA(mt-guideRNA，mt-gRNA)和定位于线粒体的Cas9核酸酶(mitoCas9，mtCas9)，即独特的mtCRISPR/Cas9系统。
2.如权利要求1所述进入线粒体的向导RNA(mt-guideRNA，mt-gRNA)，其特征在于，由RNA线粒体定位引导序列、靶向目标序列(Targetsequence)和gRNA骨架序列(gRNAscaffold)三部分组成的RNA。
3.如权利要求1所述进入线粒体的向导RNA(mt-guideRNA，mt-gRNA)，其特征在于，由RNA线粒体定位引导序列、线粒体编码的任意一种tRNA序列或其他额外间隔序列、靶向目标序列和gRNA骨架序列四部分组成的RNA。
4.如权利要求2、3所述进入线粒体的向导RNA的定位引导序列，其特征在于，所述的RNA线粒体定位引导序列可以为RP(RNaseP，RP)序列，也可以是其他能够跨膜进入线粒体基质内的，并能引导gRNA进入线粒体的序列。
5.如权利要求1所述定位于线粒体的Cas9核酸酶，其特征在于，可通过线粒体前导肽信号(Mitochondriatargetingsequence，MTS)与Cas9核酸酶的N端融合后，使其定位于线粒体。
6.如权利要求1所述定位于线粒体的Cas9核酸酶，其特征在于，可通过融合在其N端的线粒体前导肽信号(Mitochondriatargetingsequence，MTS)与融合在其N端或者C端等其他位置的强出核信号(Nuclearexportsignal，NES)共同作用，NES可使Cas9核酸酶更多地分布于细胞核外，从而使mtCas9更好地定位于线粒体中。
7.如权利要求2、4所述编码第一种mt-gRNA的DNA序列，其特征在于，编码RNA线粒体定位引导序列、靶向目标序列的DNA片段可通过两条带有线粒体引导序列和靶向目标序列的互补寡核苷酸链经退火后，由BbsI限制性酶切位点或其它合适的限制性酶切位点连入编码gRNA骨架的DNA片段中，所述互补寡核苷酸链的核苷酸序列如SEQIDNo.63和SEQIDNo.64所示。
8.如权利要求3、4所述编码第二种mt-gRNA的DNA序列，其特征在于，编码RNA线粒体定位引导序列、线粒体编码的任意一种tRNA(22种)序列、靶向目标序列的DNA片段，通过一...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂凌云，魏迪，池振奋，高敬，程东庆，冯云峰，
申请(专利权)人：聂凌云，
类型：发明
国别省市：北京;11