用于插入核酸的载体制造技术

本发明专利技术提供：一种载体，其用于在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、规定部位和由第2核苷酸序列构成的区的核酸的上述规定部位插入所期望的核酸，该载体在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区；包含该载体的试剂盒；核酸的插入方法，该方法包括向细胞中导入该载体的步骤；通过该方法获得的细胞；以及包含该细胞的生物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于在细胞内的核酸中的规定部位插入所期望的核酸的方法、以及用于该目的的载体、试剂盒、和通过该方法获得的细胞。而且，本专利技术还涉及含有包含所期望的核酸的细胞的生物、及其制备方法。
技术介绍
作为包含多个由DNA结合结构域和DNA剪切结构域构成的核酸酶亚基(亚单位)的多肽，已知有TALEN(TALE核酸酶(TALENuclease))或ZFN(锌指核酸酶(ZincFingerNuclease))等(专利文献1～4、非专利文献1)。这些人工核酸酶在DNA结合结构域的结合部位因多个DNA剪切结构域接近形成多聚体而引起DNA的双链剪切。DNA结合结构域重复包含多个DNA结合模块，各DNA结合模块识别DNA链中的特定碱基对。因此，通过适当设计DNA结合模块，可以在特定的核苷酸序列中进行特异性剪切。作为在特定的核苷酸序列中进行特异性剪切的其他核酸酶，已知有CRISPR/Cas系统等的RNA诱导型核酸酶(非专利文献2)、或使CRISPR/Cas系统与FokI核酸酶融合得到的RNA诱导型FokI核酸酶(FokI-dCas9)(非专利文献3)。通过利用在修复由这些核酸酶进行的剪切时产生的错误或重组，进行基因组DNA上的基因的缺失、插入和突变导入等各种基因修饰(参照专利文献5～6、非专利文献4)。作为利用人工核酸酶在细胞中插入所期望的核酸的方法，已知有非专利文献5～8中记载的方法。非专利文献5中记载着：利用TALEN通过同源重组插入外来DNA的方法。另外，非专利文献6中记载着：利用ZFN通过同源重组插入外来DNA的方法。但是，利用同源重组的载体无法简便地制作成长链。另外，根据细胞或生物种，有时同源重组效率低，因此这些方法只能用于有限的细胞和生物种。为了获得稳定具有插入了所期望的核酸的细胞的改良生物，向动物胚胎中导入目标核酸后使胚胎分化而获得成体是有效的，但在动物胚胎中同源重组效率低，这些方法没有效率。作为向动物胚胎中导入外来性DNA的技术，已知有ssODN介导的基因修饰，但在该技术中只能导入约数10bp左右的短DNA。非专利文献7和8中记载的方法是不利用同源重组、而利用人工核酸酶向细胞中插入核酸的方法。非专利文献7公开了下述方法：利用ZFN和TALEN剪切细胞内的核酸和应该插入的外来DNA，利用非同源末端结合(NHEJ)的作用连接两者的剪切部位，从而插入外来DNA。但是，在非专利文献7所记载的方法中，无法控制所插入的核酸的方向，所插入的核酸的连接点也不正确。非专利文献8所记载的方法是使通过核酸酶的剪切由细胞内的核酸产生的单链末端和由外来性DNA产生的单链末端相互退火后再进行连接，以能够控制方向和进行正确的连接。但是，非专利文献8所记载的方法中，为了防止对插入后的DNA再次进行剪切，必须使用异源二聚体型的ZFN和TALEN，而无法使用活性高的同源二聚体型人工核酸酶。另外，非专利文献8所记载的方法不用于向动物胚胎中插入所期望的核酸。而且，非专利文献8所记载的方法中，使单链末端在错误位点退火的发生频率高，而获得接受了正确插入的细胞的频率不高。需要说明的是，非专利文献5～8中没有记载使用CRISPR/Cas系统等的RNA诱导型核酸酶或FokI-dCas9等的RNA诱导型FokI核酸酶的方法。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2011/072246号；专利文献2：国际公开第2011/154393号；专利文献3：国际公开第2011/159369号；专利文献4：国际公开第2012/093833号；专利文献5：日本特表2013-513389号公报；专利文献6：日本特表2013-529083号公报；非专利文献非专利文献1：NatRevGenet.2010Sep;11(9):636-46；非专利文献2：NatProtoc.2013Nov;8(11):2281-308；非专利文献3：NatBiotechnol.2014Jun;32(6):569-76；非专利文献4：Cell.2011Jul22;146(2):318-31.；非专利文献5：NatBiotechnol.2011Jul7;29(8):731-4；非专利文献6：NatBiotechnol.2009Sep;27(9):851-7；非专利文献7：BiotechnolBioeng.2013Mar;110(3):871-80；非专利文献8：GenomeRes.2013Mar;23(3):539-46。
技术实现思路
专利技术所要解决的课题因此，本专利技术的目的在于获得一种不需要制作长链载体等的繁杂步骤、且可以在各种生物种细胞内的核酸的规定部位正确且简便地插入所期望的核酸的方法，该方法还可以插入达到较长链的核酸，可以与同源二聚体型的包含DNA剪切结构域的核酸酶、RNA诱导型核酸酶、或RNA诱导型FokI核酸酶组合使用。用于解决课题的手段本专利技术人着眼于夹有以插入核酸为目的的规定部位的由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区，设计了对由细胞内的核酸所含的这些区构成的部分进行特异性剪切的核酸酶。另外，本专利技术人设计了在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、以插入为目的的所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区的载体。然后，本专利技术人将所设计的载体导入细胞中，使上述核酸酶与细胞发生作用，使在细胞内的核酸中的上述规定部位发生剪切。另外，还使核酸酶与载体发生作用，生成在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区的核酸片段。如此操作，在细胞内，上述细胞内的核酸中的第1核苷酸序列和上述载体中的第1核苷酸序列通过微同源介导的结合(MMEJ)来连接，而上述细胞内的核酸中的第2核苷酸序列和上述载体中的第2核苷酸序列通过MMEJ来连接。由此，所期望的核酸被正确插入到细胞的核酸的规定部位。对达到数kb以上的较长链的核酸可以进行插入。虽然所使用的核酸酶对插入前的包含细胞内的核酸所含的由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区的部分进行特异性剪切，但连接后的核酸因插入上述所期望的核酸而失去该部分中的一部分。因此，不会受到细胞内存在的核酸酶的再次剪切，可稳定地保持，可高频率地插入所期望的核酸。由于该方法是通过在多种细胞中起作用的微同源介导的末端结合进行连接，因此对于即使同源重组效率低的发生阶段的细胞等也可以正确且高频率地插入所期望的核酸，可适用的生物和细胞的种类范围广。另外，该方法可同时对用于导入核酸酶的本文档来自技高网...

【技术保护点】
载体，该载体用于通过核酸酶在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸，其中，上述细胞所含的核酸在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述规定部位和由第2核苷酸序列构成的区，上述核酸酶对上述细胞所含的包含上述由第1核苷酸序列构成的区和上述由第2核苷酸序列构成的区的部分进行特异性剪切，上述载体在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.06 JP 2013-2303491.载体，该载体用于通过核酸酶在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸，
其中，上述细胞所含的核酸在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构
成的区、上述规定部位和由第2核苷酸序列构成的区，
上述核酸酶对上述细胞所含的包含上述由第1核苷酸序列构成的区和上述由第2核苷
酸序列构成的区的部分进行特异性剪切，
上述载体在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期
望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区。
2.载体，该载体用于通过包含第1DNA结合结构域和第2DNA结合结构域的核酸酶在
细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸，
其中，上述细胞所含的核酸在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构
成的区、上述规定部位和由第2核苷酸序列构成的区，
在上述细胞所含的核酸中，由第1核苷酸序列构成的区、上述规定部位和由第2核苷酸
序列构成的区分别位于由通过第1DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区和由通过第
2DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区之间，
其中，上述载体在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述
所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区，
在上述载体中，由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区分别位于由通
过第1DNA结合结构域识别的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：山本卓，铃木贤一，佐久间哲史，坂根祐人，
申请(专利权)人：国立大学法人广岛大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP