一种重组型核酸建构物及使用重组型核酸建构物快速回收胺基酸组成物的方法技术

一种核酸建构物，可调控且有效破裂菌株，将菌株胞内生产的重组蛋白释放于胞外，以达到方便且快速回收胺基酸组成物的目的。此核酸建构物包括一个控制表现基因的核酸物，以及可被诱导表现的基因产物；其中，一个控制表现基因的核酸物包含了一个热敏感性抑制蛋白(heat-sensitive?repressor?protein)CI857基因，λPRPL启动子和热休克蛋白(heat?shock?protein)groEL启动子，及一个lacO控制子位置(operator?site)；而可被诱导表现的基因产物包括一个噬菌体φX174溶菌基因E，结合一个噬菌体T4溶酶素基因或一个T7溶酶素基因。以生产Agrobacterium?radiobacter?NRRL?B?11291amidohydrolase(AHL)以及hydantoinase(HDT)为实施例，生产菌株具有此核酸建构物，一经温度诱导作用后，生产菌株生长随即停止，且可有效将诱导生产的重组型AHL以及HDT释放至胞外。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于，尤其关于一种在大肠杆菌生产重组蛋白质的工业化制程中，自培养基快速回收大肠杆菌所释出的蛋白质的方法。
技术介绍
人类基因体计划(Human genome project)的终极目标在于勾画出生命的基本蓝图，以便人类能藉此得以了解生理机能及窥探生命奥妙的所在；另一方面，科学家也可藉此按图索骥以破解人类基因之谜，并运用生物关键技术来解决人类遗传疾病的问题，以及发展促进人类未来福祉等相关生物技术。由于这个堪称为二十一世纪人类最伟大计划的顺利推展，也推动了许多真核和原核生物细胞基因体计划的热潮，可预期的是，未来我们将更了解许多基因的基本功用和追溯出相仿蛋白质家族间的演化历程及相关性，以及更进一步了解蛋白质体之间的相互作用对于一个细胞基本生命运作的意义。尤为重要的是，许多具有特殊功用的蛋白质亦将陆续被发现和被运用来增进人类的福祉，而重组基因技术将在此刻扮演最关键的角色。这项技术影响范围将涉及化学工业、生技医药工业、农牧渔业、能源、环境净化等领域，例如重组基因技术可将我们有兴趣的目标基因(target gene)选殖至一个适当的载体(vector)上，随后将所形成的重组型载体输送至一胜任的宿主细胞(competent host cell)中，由此所形成的重组型宿主细胞可于一适当的培养基与培养条件下进行培养，并于适当时机诱导该目标基因的表现，以大量合成所需的重组型蛋白质，这些重组型蛋白质可包括工农业用酵素、木质纤维素水解酶、治疗性蛋白质(therapeuticproteins)、干扰素(interferons)、间白素(interleukins)、激素(hormones)、生长激素(growth hormones)、抗原性多妝摆(antigenic polypeptides)、抗体(antibodies)等各类产品。利用细菌细胞如 大肠杆菌作为宿主细胞来生产重组蛋白质，目前仍是最具有经济、简单、方便等竞争条件，其原因在于大肠杆菌易于培养且生长速率快，而所需营养基质较经济、简单，并且容易将培养体积放大，菌株对于酸酵的环境条件变化较不敏感，尤其可于细胞内大量累积生产重组蛋白质。然而大肠杆菌缺乏将蛋白质外泌到细胞外的能力，因此为了纯化于胞内累积生产的重组型蛋白质时，工业传统的方法就必须使用破菌的机械设备，将胞内释放出来。藉由大肠杆菌生产重组型蛋白质的工业化下游纯化程序，主要包括(I)菌株离心回收，⑵回收菌株破裂，⑶菌液分离，⑷蛋白质纯化，(5)包装等；传统的制程，使用工业级连续式离心机将发酵后的菌株离心回收，并利用工业级的均质机予以打破，以便将于细胞内生产的蛋白质释出。然而工业级连续式离心机价格昂贵，处理时间冗长，且菌株回收效率有限；此外，工业级的均质机破菌效果相当有限，也耗费时日。为了便于回收于大肠杆菌胞内生产的重组型蛋白质，Morita等人采用嗜菌体T4溶菌基因Gpt和嗜菌体T7溶酶素来破裂大肠杆菌(Biotechnol. Prog.，2001，17 =573-576)。溶菌基因Gpt是一种已知可作用于细胞膜的蛋白质holin，而嗜菌体T7溶酶素具有可分解细胞壁的功能。Morita等人将Gpt和T7溶酶素基因选殖(clone)在一个载体上，并使用T7基因表现系统，以T7启动子来调控此两个基因的表现。以生产重组型β-glucuronidase (⑶S)为例，实验结果显示，当使用ImMisopropyl-β-D-galactoside (IPTG)的诱导剂来强制表现Gpt和T7溶酶素，可有效达到细胞溶菌的效果，并能将重组型⑶S释放于胞外。然而，以IPTG为诱导物难以达到工业化使用的目的，其主要原因为(I) IPTG的价格昂贵；(2) IPTG不被细菌代谢，易污染发酵液，而增加发酵产品纯化的困难度；(3) IPTG具有潜在的毒性，不适用于生产医疗用的产品；(4)为了达到均匀诱发细胞群的基因表现，需要使用高饱和剂量的IPTG。此外，T7基因表现是目前大肠杆菌中最强的基因表现系统，用来生产重组蛋白质最为有效。然而，该研究使用T7基因表现系统来控制Gpt和T7溶酶素的表现，此策略将使得目标蛋白无法使用T7基因表现系统来表现所欲生产的标的蛋白质，因此限制目标蛋白的生产效能；另一方面，Morita等人的研究报告中并未明述其标的蛋白质(GUS)释放出胞外的效率，以致难以评估其技术的效能。 Jiae 等人以 Morita 等人的研究技术为基石出(J. Microbiol. Biotechnol. ,2007，17 :1162-1168),发展以ptsG Pl启动子来调控Gpt和T7溶酶素的基因表现，以生产绿色荧光酶GFPuv和淀粉水解酶amylase为例，结果显示此技术虽然可以于胞外发酵液中侦测到绿色荧光酶和淀粉水解酶的活性，然经诱导后的细胞的生长却不受影响，意即无法有效达到细胞破裂的效果，同样的在此报告中也未具体叙述其标的蛋白质释放出胞外的效率。另一方面，Miksch等人则使用kil基因的功能来将生产于间膜的蛋白质释放出胞外(Appl. Mirobiol. Biotechnol. , 1997,47 :530-536),以生产葡聚醋酶 β-glucanase 为例，其结果显示此技术不会造成细胞破裂，但可将生成于间膜的葡聚醣酶释放于胞外发酵液中；然而，细胞间膜乃位于大肠杆菌的外膜和内膜的狭小空间，由于细胞质的空间远大于间膜，因此相对于间膜空间，欲生产的蛋白质在细胞质内较可大量累积生产；并且，kil基因产物可助于间膜蛋白质的释放，这意谓着细胞外膜结构受到改变而导致产生泄漏的现象，因此在工业化发酵规模所产生巨大剪应力的状况下，细胞不易于放大培养，进而限制了此技术的应用性。
技术实现思路
本专利技术技术乃于生产细胞内建构一种利用温度来诱导溶菌作用的系统，当生产菌于酸酵后，随即提高酸酵液的温度来诱发溶菌系统，以促使生产标的蛋白质的大肠杆菌破裂，而无须以工业级连续式离心机离心回收菌株，再使用工业级的均质机进行破菌处理，可说是将传统处理方法的回收菌和破菌二步骤合而为一，可有效简化处理程序、减少设备的投资，并进而大幅提升重组蛋白质的纯化效能。此外，使用本技术，除不需要在现有设备上进行大幅度的升级外，且可广泛运用于各种重组型蛋白质的生产，极具工业应用价值。附图说明图1 :质体pPL-ΦΧΕ的基因图谱。图2 :质体ΡΡΙ^-ΦΧΕ的基因图谱。图3(A):质体ρα*_ΦΧΕ0的基因图谱。图3(B):质体pET20bI_T4E的基因图谱。图3(C):质体ρα*_ΦΧΤ4Ε的基因图谱。图4 :质体ρ(Χ*Η_ΦΧΤ4Ε的基因图谱。图5(A):质体pET20bI_T7E的基因图谱。图5(B):质体ρα*Η_ΦΧΤ7Ε的基因图谱。图6 :本专利技术快速回收胺基酸组成物的方法流程图。图7 :本专利技术收获重组型菌株释出至培养基中的物质的步骤流程图。图8 :含有质体pPL-φΧΕ的大肠杆菌BL21 (DE3)的生长曲线。图9 :含有质体pPL*-cpXE的大肠杆菌BL21 (DE3)的生长曲线。图10 :含有质体Ρα*-ΦΧΕ0或ρα*_ΦΧΤ4Ε的大肠杆菌BL21(DE3)的生长曲线。图11:含有质体pCL*H-cpXT4E的大肠杆菌BL21 (DE3)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用重组型核酸建构物快速回收胺基酸组成物的方法，其特征在于，包含下列步骤：(a)构筑一第一核酸建构物，该第一核酸建构物包括一第一核酸序列及一第二核酸序列，其中该第一核酸序列包含有噬菌体φX174溶菌基因E，该第二核酸序列包含有噬菌体溶酶素基因；(b)构筑一质体含有一第二核酸建构物，其中该第二核酸建构物进一步包括一热敏感性抑制蛋白CI857基因的核酸序列，一λPRPL启动子的核酸序列，一热休克蛋白groEL启动子的核酸序列，及一lacO控制子位置的核酸序列；(c)将该第一核酸建构物植入该质体中，形成一重组型核酸建构物；(d)将步骤(c)所形成的该重组型核酸建构物转形至一个宿主细菌，得到一重组型菌株；(e)将该重组型菌株，培养于培养基中，经一温度诱导作用后，以使该第一核酸建构物表现，使细菌破裂而释出细胞内物质；(f)收获步骤(e)的该重组型菌株释出至培养基中的物质。

【技术特征摘要】
2011.10.04 TW 1001358321.一种使用重组型核酸建构物快速回收胺基酸组成物的方法，其特征在于，包含下列步骤 (a)构筑一第一核酸建构物，该第一核酸建构物包括一第一核酸序列及一第二核酸序列，其中该第一核酸序列包含有噬菌体ΦΧ174溶菌基因E，该第二核酸序列包含有噬菌体溶酶素基因； (b)构筑一质体含有一第二核酸建构物，其中该第二核酸建构物进一步包括一热敏感性抑制蛋白CI857基因的核酸序列，一 λ PkPl启动子的核酸序列，一热休克蛋白groEL启动子的核酸序列，及一 IacO控制子位置的核酸序列； (c)将该第一核酸建构物植入该质体中，形成一重组型核酸建构物； (d)将步骤(c)所形成的该重组型核酸建构物转形至一个宿主细菌，得到一重组型菌株; (e)将该重组型菌株，培养于培养基中，经一温度诱导作用后，以使该第一核酸建构物表现，使细菌破裂而释出细胞内物质； (f)收获步骤(e)的该重组型菌株释出至培养基中的物质。2.根据权利要求1所述的使用重组型核酸建构物快速回收胺基酸组成物的方法，其特征在于，步骤(a)所述的噬菌体溶酶素基因，可为T4噬菌体溶酶素基因、T7噬菌体溶酶素基因。3.根据权利要求1所述的使用重组型核酸建构物快速回收胺基酸组成物的方法，其特征在于，步骤(f)收获的该物质包括一重组型蛋白质、一不可溶内含体(inclusion)、一滞留胞内的物质、及其组合。4.根据权利要求3所述的使用重组型核酸建构物快速回收胺基酸组成物的方法，其特征在于，该重组型蛋白质包括蛋白质、酵素、抗体、胜肽、胺基酸、及其组合。5.根据权利要求4所述的使用重组型核酸建构物快速回收胺基酸组成物的方法，其特征在于，该重组型蛋白质为重组型酵素。...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵云鹏，张智翔，姜中人，
申请(专利权)人：逢甲大学，
类型：发明
国别省市：