一种扩增剑状矛蚌F型线粒体基因组序列的方法技术

一种快速扩增剑状矛蚌F型线粒体基因组序列的方法，通过提取总DNA、普通PCR扩增及测序、设计长片段引物、LA-PCR扩增及测序和序列拼接，获得了剑状矛蚌F型线粒体基因组序列，该序列全长15732bp，包括13个蛋白质基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和28个长度为2到349bp的非编码区。本发明专利技术首次公布了获得剑状矛蚌F型线粒体基因组序列的方法，为蚌科的系统发生学、比较和进化基因组学、谱系基因组学、种质资源保护、可持续和合理地利用奠定提供重要的基础材料。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，涉及基因组序列的扩增方法。 技术背景 剑状矛蛛（Lanceolaria gladiola)隶属于瓣鲍纲蛛科矛蛛属，软体动物，栖息于 我国湖泊、河流及池塘的沙泥底中，贝壳坚厚，中等大小，壳前端有颗粒状的花纹，贝壳多呈 灰褐色，外形窄长，呈剑状。长度约为高度的4. 5倍。蚌类具有一定的经济价值，如培育珍 珠，发展我国的珍珠养殖业，提取抗肿瘤成分，许多贝壳较厚的种类可作为制造纽扣贝雕等 工艺品的原料，一些贝壳闪亮的珍珠层可以用来制造各种精美的螺细、器皿和家具等。此 外，淡水贝壳的石灰质可作为家禽的饲料，软体部分可供食用，是肉食性鱼类的良好饲料， 对水环境中Cu、Zn和Cd有去除与积累的作用，吸收富集重金属，改良水质。蚌科动物是淡 水贝类最大的一个科，包括674个物种，淡水蚌类是淡水生态系统中一类重要的水生生物， 作为滤食者，能够通过滤食营养物质、有机物和浮游生物来改良水质，对水环境还有生物监 测的作用。淡水蚌类在淡水生态系统中不可或缺，其生物量和密度往往都在底栖动物中占 优势，对淡水生态系统有重要作用，如果淡水湖泊或者是河流中的淡水蚌类消失，将会引起 一系列的生态问题。总而言之，淡水蚌类对淡水生态系统至关重要，对水体的水质、物质循 环和能量流动作用巨大，且具有较高的营养、经济和生态价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速扩增剑状矛蚌F型线粒体基因组序列的方法。为了 实现上述目的，本专利技术所解决的技术问题采用以下技术方案来实现。 本专利技术所述方法包括下列步骤： (1)提取蚌的总DNA ; (2)利用保守引物分别对coxl、16SrRNA和nadl基因进行普通PCR扩增并测序； (3)根据测序结果设计长片段引物进行LA-PCR扩增并测序； (4)序列拼接； (5)基因注释。 所述的长片段引物包括以下三对： C0I-16S-F :5' CGTAACAGCCCAAACAAATA 3' C0I-16S-R :5'CAGAGGTACAAGAAAAGGTAAAGT 3' 16S-NDI-F :5'TGGGGCAATCTTGGAACC 3' 16S-NDI-R :5'GCTATAAACAGGAAAGCAAAACC 3' NDI-COI-F :5'TAGTCTCAGGGTTCAACATCG 3' NDI-COI-R :5,CACTCTGGGGCTTCGGT 3,。 本专利技术首次公开了剑状矛蚌的线粒体基因组，也是首次公开了一种扩增剑状矛蚌 线粒体基因组序列的方法，可以为蚌科的线粒体基因组学研究和种质资源保护提供重要的 基础材料。 线粒体基因组DNA是裸露的双链超螺旋共价闭合环状分子，少数为线状分子（如 原生动物草履虫与四膜虫的mtDNA)，是真核细胞的第二遗传信息系统，或称核外基因及其 表达体系。相对于核DNA，mtDNA具有分子量小、多态性高、结构简单、碱基突变率高、母系遗 传、进化速度快等特点，已被广泛应用于生理病理、临床诊断、遗传变异、分子标记、系统进 化等多方面的研究，与线粒体和线粒体基因组相关的研究已成为临床医学、进化生物学、基 因组学、生物信息学等生命科学领域的研究热点和前沿。 蚌科动物线粒体的遗传不单单是母系遗传，还存在线粒体基因组遗传的一 种特例--双单亲遗传现象（Doubly-Uniparental Inheritance, DUI)。这种遗传方 式使后代中雌性mtDN只来自母系（female-transmitted, F type)，与严格的母系遗 传相似；而雄性的mtDNA来自双亲，在体细胞中存在F型mtDNA，在精巢中存在父系 mtDNA(male-transmitted, M type)。 本专利技术的有益效果：通过设计的特异性长片段引物，通过LA-PCR技术对剑状矛蚌 F型线粒体基因组进行扩增，再进行测序、拼接和校正，获得了剑状矛蚌F型线粒体基因组 全序列。本专利技术获得的剑状矛蚌F型线粒体基因组序列总长15732bp，可从组成和结构的角 度对剑状矛蚌F型线粒体基因组进行分析，可以丰富蚌科线粒体基因组信息，为蚌类的系 统发育、种质资源保护、可持续和合理地利用奠定重要的分子遗传学理论基础。【具体实施方式】 下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发 明保护的范围。 -种扩增剑状矛蚌F型线粒体基因组序列的方法如下： 1、总 DNA 提取： 使用购自天根生化科技有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，提取剑 状矛蚌的总DNA，包括以下步骤： (1)剪取剑状矛蚌新鲜闭壳肌组织100_150mg，置于I. 5ml已灭菌离心管中，用洁 净的灭好菌的剪刀充分剪碎放入装有2001 GA缓冲液的离心管中，涡旋振荡15sec。 (2)加入201 proteinase K(20mg/ml)溶液，祸旋混勾，简短离心以去除管盖内壁 的水珠。在56°C放置，直至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 (3)加入2001缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置lOmin，溶液应变清亮，简短离心 以去除管盖内壁的水珠。 (4)加入2001无水乙醇，充分颠倒混勾，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去 除管盖内壁的水珠。 (5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12000rpm(~13400*g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 (6)向吸附柱CB3中加入5001缓冲液⑶(⑶中已加入无水乙醇），12000rpm(~ 13400*g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 (7)向吸附柱CB3中加入6001漂洗液PW(PW中已加入无水乙醇），12000rpm(~ 13400*g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 (8)重复操作步骤7。 (9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(~13400*g)离心2min，倒掉废液，将 吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 (10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50-200 μ 1洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm (~13400*g)离心2min，将溶液收集 到离心管中。当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扩增剑状矛蚌F型线粒体基因组序列的方法，其特征是包括下列步骤：(1)提取蚌的总DNA；(2)利用保守引物分别对cox1、16SrRNA和nad1基因进行普通PCR扩增并测序；(3)根据测序结果设计长片段引物进行LA‑PCR扩增并测序；(4)序列拼接；(5)基因注释。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周春花，柯美林，欧阳珊，吴小平，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36