本发明专利技术公开了一种巨魾鱼线粒体全基因组测序的方法，属于水产生物技术领域。所述的巨魾鱼线粒体全基因组测序的方法，包括以下步骤：巨魾鱼基因组DNA提取，设计18对同源性引物；进行PCR扩增，回收目的片段，载体连接、转化、克隆、测序；进行序列拼接获得全长巨魾鱼的线粒体基因序列。本发明专利技术提供的方法方便巨魾鱼的线粒体全长基因的克隆，为群体遗传分析提供方便，其适合于在巨魾鱼中实现对线粒体基因分子遗传及群体结构的评价；对巨魾鱼的资源保护提供基础性资料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水产生物
，特别涉及一种巨魅鱼线粒体全基因组测序的方 法。
技术介绍
巨魅（Bagariusyarrelli Sykes)属于鲇形目，姚科，魅属。俗名"黄鱼"，肉呈黄 色，个体很大，且食性主要为虾、泥鳅、小鱼和水生昆虫等。通过对其外部形态，消化系统，繁 殖和生活习性等多方面的初步研宄，已确定巨魅为底栖肉食性淡水鱼类，其消化系统和外 部形态结构特征都有较好的适应性，巨魅产漂浮性卵，有良好的繁殖特性。在云南省的澜沧 江、怒江、元江都有巨魅的分布。这些江水含泥沙量很大致使江水十分混浊，但巨魅仍能正 常生活。可见巨魅对含泥沙的混浊水质适应能力强。 近年来，由于渔业生态环境的破坏加剧，水体污染严重和鱼类的过度捕捞，鱼类资 源严重遭到破坏。因此利用线粒体基因克隆技术对巨魅的遗传多样性分析，研宄野生巨魅 鱼的遗传结构，探讨群体间的遗传变异，对其种质资源保护以及合理开发提供参考。但有关 线粒体全基因克隆技术，目前国内外尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种巨魅鱼线粒体全 基因组测序的方法。本专利技术设计出18-20对引物，并找到合适的退火温度和反应体系，经过 克隆测序并经过软件拼接，即可获得该巨魅鱼线粒体基因的全长，本专利技术所用方法方便巨 魅鱼的线粒体全长基因的克隆，为群体遗传分析提供方便。 本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种巨魅鱼线粒体全基因组测序的方法， 包括以下步骤： (1)巨魅鱼基因组DNA提取：取0· lg-o. 5g鳍条组织到I. 5ml的离心管中，加入 DNA提取液600 μ1，再加入蛋白酶Κ8-10μ1及5μ1 RNA酶，上下轻轻转动混匀；然后再加 入等体积的体积比25 :24 :1的酚/氯仿/异戊醇，上下轻轻转动混匀，4°C下12000转/分 离心10分钟，取上清，然后再加入等体积的体积比为24 :1的氯仿/异戊醇，上下轻轻转动 混匀，4°C下12000转/分离心10分钟；向上清液中加2倍体积的冰冷无水乙醇，使DNA沉 淀10-25分钟，70%乙醇漂洗沉淀，用TE溶解DNA，获得巨魅鱼基因组DNA，于-20°C保存备 用； ⑵同源性引物的设计：设计获得18对扩增引物对，18对扩增引物的序列如Seq ID NO 1~36所示； (3)正式PCR扩增：反应的总体积为50 μ 1，包含IOOng的模板DNA，2 X Taq PCRMaster Mix 25μ1,正向引物2μ1，反向引物2μ1，CldH2O 19yl;PCR反应程序为 94°C 4min，然后30个循环：94°C预变性30s，引物退火温度，72°C延伸2min ;最后72°C延伸 6min ;获得PCR扩增产物，4°C保存； (4)目的片段的回收：用TIANGEN试剂公司的凝胶回收试剂盒，按试剂盒说明对步 骤⑶中PCB扩增产物进行割胶回收获得1000-1500bpDNA目的片段； (5)载体连接、转化、克隆测序：将步骤⑷中回收的PCR产物进行连接、转化、克 隆、测序，将所得的序列与网上的相近种属的序列用DNAMN软件进行比对； (6)序列拼接：利用DNAMAN软件或者手动将相邻的引物扩增的序列进彳丁拼接，最 终获得全长巨魅鱼的线粒体基因序列。 步骤（3)中所述的引物退火温度优选为：引物对1的退火温度范围为 53 °C -58.6 °C，引物对2的退火温度范围为53 °C -58.6 °C，引物对3退火温度范围为 52. 3 °C -59. 4°C，引物对4退火温度范围为58. 4 °C -62. 7 °C，引物对5退火温度范围为 50-54. 2°C，引物对6退火温度范围为50°C _62°C，引物对7退火温度范围为50°C -61. 5°C， 引物对8退火温度范围为53°C -58. 6°C，引物对9退火温度范围为54. 2°C -60. 8°C，引物 对10退火温度范围为57. 2°C -63. 8°C，引物对11退火温度范围为50. 6-58. 3°C，引物对12 退火温度范围为50 °C -55. 7 °C，引物对13退火温度范围为47 °C -51. 6 °C，引物对14退火温 度范围为55°C -61. 9°C，引物对15退火温度范围为50°C -59. 8°C，引物对16退火温度范 围为55°C -60. 2°C，引物对17退火温度范围为50°C -59. 8°C，引物对18退火温度范围为 50°C -58°C。 步骤（6)中所述的全长巨魅鱼的线粒体基因序列如Seq ID NO :37所不。 巨魅鱼线粒体全基因组的克隆测序需要设计不同的引物，而如果设计不好，就有 可能扩增不出所需要的目的片段，本专利技术就是找到一种方法，设计不同的引物序列，找到适 当的退火温度并且克隆测序，最终组装出巨魅鱼的线粒体全基因组序列。 本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果： 本专利技术只需要设计出18对引物，引物序列如Seq ID NO 1~36所示，并找到合适 的退火温度和反应体系，经过克隆测序并经过软件拼接，即可获得该巨魅鱼线粒体基因的 全长；方便此类鱼的线粒体全长基因的克隆，为群体遗传分析提供方便，其适合于在水产动 物中实现对线粒体基因分子遗传及群体结构的评价；本专利技术建立巨魅鱼的线粒体全基因的 克隆体系，实现从分子水平上对巨魅鱼的遗传结构及进化历史进行研宄，从而对巨魅鱼的 资源保护提供基础性资料。【附图说明】 图1为巨魅鱼基因组的DNA检测结果图，其中：M代表DNAMarker ;1，2,3,4,5,6分 别代表不同的巨魅鱼个体。 图2为巨魅鱼线粒体基因组扩增引物的梯度PCR扩增结果图，其中：M代表 DNAMarker ;1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12代表不同退火温度下的扩增的PCR产物条带； 1 为 45°C，2 为 46°C，3 为 47. 3°C，4 为 49. 3°C，5 为 51. 9°C，6 为 54. 4°C，7 为 56. 5°C，8 为 58. 8°C，9 为 61. 3°C，10 为 63. 2°C，11 为 64. 2°C，12 为 65°C。 图3为设计的引物在适当的退火温度下巨魅鱼线粒体基因组片段扩增图，其中：M 代表DNAMarker ;1，2,3,4,5,6,7,8,9，10，11代表不同引物在适当的退火温度下扩增的？〇? 产物片段条带。【具体实施方式】 下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限 于此。 实施例1 一种巨魅鱼线粒体全基因组测序的方法，包括以下步骤： (1)巨魅鱼基因组DNA提取：取0. lg-0. 5g鳍条组织到I. 5ml的离心管中，加入DNA 提取液600 μ 1，再加入蛋白酶K8-10 μ 1及5 μ I RNA酶，上下轻轻转动混匀；然后再加入等 体积的体积比25 :24 :1的酚/氯仿/异戊醇，上下轻轻转动混匀，4°C下12000转/分离心 10分钟，取上清，然后再加入等体积的体积比为24 :1的氯仿/异戊醇，上下轻轻转动混匀， 4°C下12000转/分离心10分钟；向上清液中加2倍体积的冰冷无水乙醇，使DNA沉淀10-25 分钟，70%乙醇漂洗沉淀本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种巨魾鱼线粒体全基因组测序的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)巨魾鱼基因组DNA提取：取0.1g‑0.5g鳍条组织到1.5ml的离心管中，加入DNA提取液600μl，再加入蛋白酶K 8‑10μl及5μl RNA酶，上下轻轻转动混匀；然后再加入等体积的体积比25：24：1的酚/氯仿/异戊醇，上下轻轻转动混匀，4℃下12000转/分离心10分钟，取上清，然后再加入等体积的体积比为24：1的氯仿/异戊醇，上下轻轻转动混匀，4℃下12000转/分离心10分钟；向上清液中加2倍体积的冰冷无水乙醇，使DNA沉淀10‑25分钟，70％乙醇漂洗沉淀，用TE溶解DNA，获得巨魾鱼基因组DNA，于‑20℃保存备用；(2)同源性引物的设计：设计获得18对扩增引物对，18对扩增引物的序列如Seq ID NO 1～36所示；(3)正式PCR扩增：反应的总体积为25μl，包含100ng的模板DNA，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl,正向引物1μl，反向引物1μl，ddH2O 9.5μl；PCR反应程序为94℃4min，然后30个循环：94℃预变性30s，引物退火温度，72℃延伸2min；最后72℃延伸6min；获得PCR扩增产物，4℃保存；(4)目的片段的回收：用TIANGEN试剂公司的凝胶回收试剂盒，按试剂盒说明对步骤(3)中PCB扩增产物进行割胶回收获得1000‑1500bpDNA目的片段；(5)载体连接、转化、克隆测序：将步骤(4)中回收的PCR产物进行连接、转化、克隆、测序，将所得的序列与网上的相近种属的序列用DNAMAN软件进行比对；(6)序列拼接：利用DNAMAN软件或者手动将相邻的引物扩增的序列进行拼接，最终获得全长巨魾鱼的线粒体基因序列。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜民，刘艳红，周传江，牛宝珍，李娜，
申请(专利权)人：红河学院，
类型：发明
国别省市：云南;53
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