本发明专利技术公开了一种磁性固定化芽胞漆酶及其制备方法与应用，属于固定化技术领域和废水处理领域。本发明专利技术公开的固定化芽胞漆酶以Fe3O4磁性纳米粒子为载体，通过双功能交联剂将磁性纳米粒子直接固定在芽胞表面；其可通过外加磁场进行快速分离，并反复使用。本发明专利技术公布的磁性芽胞漆酶制备方法不需要对磁性纳米粒子进行表面修饰，其过程仅包含芽胞的制备、固定化处理和收集三个步骤，大大降低了制备过程的操作要求，还大大节约了固定化芽胞漆酶的制备成本。本发明专利技术提供的磁性固定化芽胞漆酶可直接用于染料的脱色处理，并保持较高的脱色效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种固定化芽胞漆酶及其制备与应用，属于固定化
和废水处 理领域。
技术介绍
漆酶（Iaccase)是一种含铜多酚氧化酶，广泛分布于真菌、细菌、植物和昆虫之 中。漆酶可以氧化酚类物质，在介体的辅助作用下，还可以氧化非酚类物质，在染料脱色、饮 料处理，制浆漂白以及生物传感器开发中都有研究和应用。芽胞漆酶是指固着在芽胞外衣 上的漆酶，是最具代表性的细菌漆酶，其以芽胞作为研究单位，具有耐碱性耐高温的特点， 在纺织染料脱色应用中具有明显优势。 近年来对于芽胞漆酶的研究仍处在生化特性描述和简单的染料脱色应用研究上， 极少有芽胞漆酶固定化的报道。对酶进行固定化通常可以提高酶的稳定性、易于酶的分离， 而且可以提高酶的重复使用率，降低工业化应用的成本。在众多的固定化载体中，磁性纳米 粒子是一类非常独特的材料。磁性纳米粒子的直径和重量都极小，且具有超顺磁性，这使得 其在使用过程中分散均匀，在使用结束后极易被分离出来。磁性固定化的实施方案非常多， 纳米粒子的种类，表面修饰与否，修饰基团类型，固定化的条件等等都会影响酶的固定化效 率以及固定化酶的最终使用性能。选择一种经济、简便而且高效的方案在工业化应用中极 为重要。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种简便可行的芽胞固定化方法，以此方法制备得到可重复利用 的固定化芽胞漆酶，并应用于染料脱色。 所述固定化芽胞漆酶通过以下步骤来制备： (1)制备芽胞杆菌属菌株所产的芽胞； (2)固定：称取0· Ig Fe3O4磁性纳米粒子（粒径为5 - 30nm)，加入到5 - 15ml 0. 02MNa2HP04- NaH2PO4缓冲液（pH7,其中含 0.1 MNaCl)，加入0. 5 - 2. Oml 碳二亚胺盐酸盐 (4mg/ml)，超声处理lOmin，接着加入0· 1 - 1.0 ml芽胞（100mg/ml，湿重），超声处理30min， 然后置于50 - 250rpm，4 一 40°C条件下旋转振荡20 - 240min ; (3)回收：将完成固定化的混合液通过磁铁吸附进行分离，用缓冲液冲洗1 一 5 次，分别收集上清液和固定化芽胞，保藏于〇 - 40°C。 在本专利技术的一种实施方式中，步骤（1)所述的芽胞制备包括以下步骤： ①将产漆酶的芽胞杆菌属菌株在37°C条件下在生孢培养基上培养2d ; ②以8000rpm的离心速度对上述培养物进行IOmin的离心，收集芽胞； ③水洗芽胞1次； ④水洗所得的的芽胞加入溶菌酶使其终浓度为lmg/ml，在37°C条件下保温2h。 ⑤培养物经溶菌酶处理后，先后经IM NaCl和IM KCl洗，8000rpm离心10min收集 芽胞。 ⑥对芽胞进行湿重称量，用去离子水重悬芽胞，浓度为100mg/ml。 其中，所述的芽胞产生菌株包括但不限于Bacillus pumilus W3。 在本专利技术的一种实施方式中，步骤（2)所述的Fe3O4磁性纳米粒子粒径为20nm。 在本专利技术的一种实施方式中，步骤（2)所述的固定化体系为0.1 g Fe3O4磁性纳米 粒子：IOml Na2HPO4+ NaH2PO4缓冲液：Iml碳二亚胺盐酸盐：0. 5ml芽胞。 在本专利技术的一种实施方式中，步骤（2)所述固定化混合物经超声处理后在 200rpm，37°C条件下旋转振荡30min。 本专利技术还提供应用上述固定化芽胞漆酶对染料废水进行脱色处理的方法，是向染 料废水中添加适量固定化芽胞漆酶，在适当温度、PH条件下，对纺织染料废水进行脱色处 理。 所述染料废水中的染料包括但不限于甲基绿、甲基红和酸性红1。 所述脱色处理的pH条件可以为7. 0。不同染料的最适脱色pH值可能会有不同。 所述脱色处理的的温度范围为30 - 70°C。 所述脱色处理可以在150rpm - 250rpm转速的摇床或搅拌速度下进行，也可以通 过流化床以及其他形式来进行。 所述脱色处理的时间可以是24 - 48h。 所述脱色处理过程中，可以添加2, 2' -联氮基-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸） 二铵盐作为介体，也可以添加其他化合物作为介体或不添加介体。介体添加浓度可以为 0.1 mM0 针对混合染料脱色时，可先利用游离芽胞漆酶作为催化剂先确定漆酶对混合染料 脱色条件的偏好。 本专利技术的优点和有益效果在于：（1)本专利技术提供了一种结合稳定的固定化芽胞漆 酶，其可通过外加磁场进行快速分离，并可反复使用。（2)本专利技术提供的固定化芽胞漆酶制 备方法，该方法不需要对磁性纳米粒子进行表面修饰，这大大降低了制备过程的操作要求， 还大大节约了固定化芽胞漆酶的制备成本。（3)本专利技术所提供的固定化芽胞漆酶可直接应 用于染料脱色，并保持较高的脱色效率。【具体实施方式】 漆酶酶活测定方法：称取0.1 g固定化芽胞漆酶置于3. 5ml柠檬酸磷酸盐缓冲液 (0. 1M，pH 6. 8)中，在37°C保温15min，添加底物反应5min，然后进行IOmin的冰水浴以终 止反应，利用磁铁吸附固定化芽胞，取上清液检测吸光值。底物为丁香醛连氮（0.05mM)，检 测波长为525nm〇 酶活回收率=固定化芽胞漆酶酶活八初始酶活一上清液酶活）X 100% 初始酶活是指：游离芽胞漆酶酶活。以该游离芽胞漆酶作为对照组，其芽胞量和处 理过程与固定化芽胞漆酶相同（不添加载体）。 上清液酶活是指：芽胞与Fe3O4磁性纳米粒子混合固定化处理后，上清液中残余酶 活。 脱色率用分光光度法在各染料的最大吸收波长处进行检测，各染料的最大吸收波 长分别为λ = 630nm(甲基绿），λ = 435nm(甲基红）和λ = 531nm(酸性红1)。 脱色率=(对照组吸光值一实验组吸光值）/对照组吸光值X 100% 实施例1芽胞漆酶的生产 将Bacillus pumilus W3菌株在37°C条件下于生抱培养基上培养2d，以8000rpm 的离心速度对上述培养物进行IOmin的离心，收集芽胞，然后水洗芽胞1次，将水洗所得的 芽胞加入溶菌酶使其终浓度为lmg/ml，在37 °C条件下保温2h，培养物经溶菌酶处理后，先 后经IM NaCl和IM KCl洗，8000rpm离心10min收集芽胞；对芽胞进行湿重称量，用去离子 水重悬芽胞，浓度为l〇〇mg/ml。 实施例2固定化方案1 称取0· Ig Fe304·性纳米粒子（粒径为20nm)，加入到5ml 0· 02M Na 2ΗΡ04- NaH2PO4缓冲液（pH 7,其中含0.1 M NaCl)，加入0. 5ml碳二亚胺盐酸盐（4mg/ml)，超声处理 lOmin，接着加入0. 2ml芽胞（100mg/ml，湿重），超声处理30min，然后置于200rpm，37°C条 件下旋转振荡60min ;将完成固定化的混合液通过磁铁吸附进行分离，用缓冲液冲洗3次， 分别收集上清液和固定化芽胞，保藏于4°C。经测得酶活回收率为92. 97%。 实施例3固定化方案2 称取0.1 g Fe3O4磁性纳米粒子（粒径为20nm)，加入到IOml 0. 02M Na 2ΗΡ04- NaH2PO4缓冲液（pH 7,其中含0.1 M NaCl)，加入0. 5ml碳二亚胺盐酸盐（4mg/ml)，超声处理 lOmin，接着加入0本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种磁性固定化芽胞漆酶，其特征在于，以未经表面修饰的Fe3O4磁性纳米粒子为载体，通过双功能交联剂将磁性纳米粒子结合在芽胞表面。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：管政兵，周稳，廖祥儒，蔡宇杰，伊海希，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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