一种直接从发酵液中固定化单宁酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种直接从发酵液中固定化单宁酶的方法。该方法包括：（1）以塔宾曲霉为产酶菌株发酵铁观音茶梗获得游离粗单宁酶；（2）以亲水性超顺磁性纳米颗粒为游离单宁酶固定化载体；（3）采用直接固定化、戊二醛交联以及碳二亚胺共价结合三种方法将游离单宁酶固定在纳米颗粒上获得流体状固定化单宁酶；（4）真空冷冻干燥流体状固定化单宁酶获得粉末状固定化单宁酶。本方法直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶，简单、快速的制备了磁性纳米固定化单宁酶。该固定化单宁酶具有良好的酶活力、存储稳定性、重复利用性以及磁操纵性能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物发酵以及酶固定化
，尤其涉及一种直接从发酵粗酶液中 固定化单宁酶的方法。
技术介绍
单宁酶在食品、医药、饲料，尤其是在茶饮料行业有着极为重要的应用价值。目前， 单宁酶主要通过微生物发酵获得粗酶液，再经一系列的分离纯化操作获得一定纯度的单宁 酶。单宁酶的纯化是一个复杂且昂贵的过程，这也是致使单宁酶成本居高不下的关键原因， 并最终限制了单宁酶在工业中的规模化应用。 酶固定化技术是一种通过吸附、交联、共价结合或包埋等方法将游离酶固定在特 定载体上的技术，可显著提高酶的稳定性和重复利用率，从而降低酶的使用成本。将单宁酶 进行固定化将有助于解决单宁酶使用成本过高的难题，有助于实现其在工业生产中的规模 化应用。 有鉴于此，本专利技术人研宄和设计了一种直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶的方 法，本方案由此产生。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，简易、快速、低 成本制备具有可重复利用、可磁操纵的磁性纳米固定化单宁酶。 本专利技术的目的通过如下技术方案实现： 一种直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶的方法，包括以下步骤： 步骤一、产单宁酶菌株种子制备：将塔宾曲霉菌种活化，扩大培养获得发酵种子液； 步骤二、单宁酶发酵培养基制备及单宁酶发酵：固体发酵基质中添加蔗糖、葡萄糖、硫 酸铵和酵母浸膏作为外加碳氮源，润湿后搅拌均匀后高压蒸汽灭菌，冷却至室温接种塔宾 曲霉种子液，搅拌均匀后恒温静置固态发酵获得单宁酶； 步骤三、游离酶制备：发酵结束后，发酵物中加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浸提培养基 中单宁酶，减压真空过滤混合液收集滤过液获得游离单宁酶； 步骤四、酶固定化载体制备：以FeCl#PFeCl2为原料，加热搅拌条件下加入浓氨水采用 共沉淀法获得Fe304磁性纳米粒子，再经油酸反应包裹磁性纳米粒子表面获得亲油性、具有 活性基团的纳米粒子，高锰酸钾改性油酸包裹的纳米粒子表面活性基团，搅拌加热使制备 得到的流体状磁性纳米粒子后，磁分离后经真空冷冻干燥后获得粉末状、具有亲水性、表面 羧基功能化的磁纳米载体； 步骤五、单宁酶固定化及固定化酶制备：超声均匀分散磁性纳米载体于磷酸盐缓冲溶 液中，将游离单宁酶与分散均匀的磁性纳米载体混合均匀进行直接固定化、戊二醛交联固 定化或碳二亚胺共价结合固定化游离单宁酶；磁分离固定化酶，纯水洗涤数次至洗涤液呈 中性，真空冷冻干燥流体状单宁酶获得干粉状固定化单宁酶。 作为实施例的优选方式，所述步骤一中产单宁酶菌株为 to办CICC2651，斜面菌种转接于PDA斜面活化培养96h，0. 8%无菌吐温-80溶液 洗涤斜面孢子，制备浓度为1. 5X107个/mL的孢子悬液，接种孢子悬液5mL于250mL摇 瓶中，摇瓶中培养基为H)，即PDA去除琼脂，装量为100mL，每瓶加5粒直径0.5cm的玻璃 珠，28°C培养72h获得塔宾曲霉发酵种子液。 作为实施例的优选方式，所述步骤二中固体发酵基质为干燥的铁观音茶梗粉末过 40目筛下物，蔗糖添加量为9%、葡萄糖添加量3%、硫酸铵添加量6%，酵母浸膏添加量0. 5%， 固水比按质量体积比为1:2,灭菌温度和时间分别为121°C和15min;接种量为每克培养基 接种0.5mL发酵种子液，培养温度为30°C，发酵为120h。 作为实施例的优选方式，所述步骤三中，发酵物中加入的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲 液的pH为5. 0,固液比按质量体积比为1:5-20，浸提温度20-30°C、摇床转速0-250rpm、浸 提时间10-60min，混合液过滤方式为真空减压过滤。 作为实施例的优选方式，所述步骤三中，固体发酵物与浸提液比例优选1:1〇,浸提 温度优选25°C，摇床转速优选180rpm，浸提时间优选30min。 作为实施例的优选方式，所述步骤四中，混合液中的Fe3+和Fe2+的摩尔量比约为 1:2、加热温度70°C、搅拌速度750rpm，浓氨水添加量为总体积的1/10,油酸滴加量为总反 应体积的1/30,后熟温度80°C、搅拌速度600rpm、时间2h;高锰酸钾溶液浓度为10mg/mL， 超声振荡时间为3h，-80°C真空冷冻干燥时间为48h。 作为实施例的优选方式，所述步骤五中，直接固定化的步骤为：取亲水性超顺磁性 纳米载体1g置于反应瓶中，加入100mLpH为7. 0的磷酸盐缓冲液，超声5min使得载体 分散均勾；加入150mL游离单宁酶，30°C、180rpm固定化24h;永磁铁磁分离固定化酶，蒸 馏水洗涤流体状固定化酶直至洗涤液呈中性；-80°C真空冷冻干燥48h;获得粉末状具有 超顺磁性的单宁酶固定化纳米载体。 作为实施例的优选方式，所述步骤五中，戊二醛交联固定化的步骤为：取亲水性超 顺磁性纳米载体1g置于反应瓶中，加入100mLpH为7.0的磷酸盐缓冲液，超声5min使得 载体分散均匀；加入150mL游离单宁酶、25mL戊二醛（25%)，30°C、180rpm固定化24h; 永磁铁磁分离固定化酶，蒸馏水洗涤流体状固定化酶直至洗涤液呈中性；_80°C真空冷冻干 燥48h;获得粉末状具有超顺磁性的单宁酶固定化纳米载体。 作为实施例的优选方式，所述步骤五中，碳二亚胺共价结合固定化的步骤为：取亲 水性超顺磁性纳米载体1g置于反应瓶中，加入100mLpH为7. 0的磷酸盐缓冲液，超声5 min使得载体分散均勾；加入150mL游离单宁酶、13. 8mL浓度为0.lmmol/L的碳二亚胺 /羟基琥珀酰亚胺，30°C、180rpm固定化24h;永磁铁磁分离固定化酶，蒸馏水洗涤流体状 固定化酶直至洗涤液呈中性；-80°C真空冷冻干燥48h;获得粉末状具有超顺磁性的单宁 酶固定化纳米载体。 本专利技术采用上述技术方案后，简单、快速的利用表面具有活性基团的磁性纳米粒 子从单宁酶发酵粗酶液中选择性的直接固定化单宁酶，同时达到单宁酶纯化和固定化的双 重目标。获得的磁性纳米固定化单宁酶具有良好的重复利用性以及可磁操纵性能。【附图说明】 图1磁性纳米固定化单宁酶的制备流程。【具体实施方式】 下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步详细的阐述，但本专利技术的实施方式并不 局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本专利技术，而非用于限制本专利技术的范围。此 外，在阅读本专利技术的内容后，本领域的技术人员可以对本专利技术作各种修改，这些等价变化同 样落于本专利技术所附权利要求书所限定的范围。实施例中使用的实验试剂如无特殊说明则均 为市面上可通过商业渠道购置的试剂。 下列实施例中采用的检测方法： 固定化单宁酶酶活检测方法：（1)将载体与固定化酶分别用一定量柠檬酸缓冲液悬浮 均匀备用。（2)取3支试管分别标记为空白管、对照管和测试管，各加入0.5mL底物没食 子酸丙酯（0.01mol/L)。（3)空白管中加入0.5mL柠檬酸缓冲液（0.05mol/L，pH5.0)， 测试管中加入0.5mL固定化酶，对照管中加入等量载体，所有处理均30°C水浴5min。（4) 永磁铁磁分离测试管与对照管中的固定化酶和载体，反应液加入0. 6mL甲醇绕丹宁溶液 (6.67g/L)，30°C水浴 5min。（5)加入 0.4mLK0H(0.7mol/L)，30°C保温 5min。（6)所 有处理中均加入8mL蒸馏水，振荡均匀后30本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、产单宁酶菌株种子制备：将塔宾曲霉菌种活化，扩大培养获得发酵种子液；步骤二、单宁酶发酵培养基制备及单宁酶发酵：固体发酵基质中添加蔗糖、葡萄糖、硫酸铵和酵母浸膏作为外加碳氮源，润湿、搅拌均匀后高压蒸汽灭菌，冷却至室温接种塔宾曲霉种子液，搅拌均匀后恒温静置固态发酵获得单宁酶；步骤三、游离酶制备：发酵结束后，发酵物中加入柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液浸提培养基中单宁酶，减压真空过滤混合液收集滤过液获得游离单宁酶；步骤四、酶固定化载体制备：以FeCl3和FeCl2为原料，加热搅拌条件下加入浓氨水采用共沉淀法获得Fe3O4磁性纳米粒子，再经油酸反应包裹磁性纳米粒子表面获得亲油性、具有活性基团的纳米粒子，高锰酸钾改性油酸包裹的纳米粒子表面活性基团，搅拌加热使制备得到的流体状磁性纳米粒子后，磁分离后经真空冷冻干燥后获得粉末状、具有亲水性、表面羧基功能化的磁纳米载体；步骤五、单宁酶固定化及固定化酶制备：超声均匀分散磁性纳米载体于磷酸盐缓冲溶液中，将游离单宁酶与分散均匀的磁性纳米载体混合均匀进行直接固定化、戊二醛交联固定化或碳二亚胺共价结合固定化游离单宁酶；磁分离固定化酶，纯水洗涤数次至洗涤液呈中性，真空冷冻干燥流体状单宁酶获得干粉状固定化单宁酶。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖安风，吴昌正，倪辉，蔡慧农，杨秋明，杜希萍，李利君，黄高凌，陈艳红，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35