一种高性能M‑MLV逆转录酶的制备方法技术

本发明专利技术是一种高性能M‑MLV逆转录酶的制备方法，包括突变体克隆构建，所构建的突变体质粒序列均经过测序确认，得到17个突变体质粒；然后进行突变体的筛选：将野生型pET28b‑M‑MLV和17个突变体质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞中，培养、诱导突变酶表达；收集菌体获得突变酶粗提液；选择有蛋白表达的突变酶粗提液，在不同温度下进行逆转录活性筛选：将活性筛选结果阳性的突变体在液体培养基中培养、诱导蛋白表达；收集菌体纯化得到M‑MLV逆转录酶。本发明专利技术方法采用分子理性设计与功能筛选相结合，在较小范围内筛选即获得高热稳定性M‑MLV逆转录酶，其热稳定性达到耐热能力65°C。

A method for preparing high performance M MLV reverse transcriptase

The invention relates to a preparation method of high performance M MLV reverse transcriptase mutant, including cloning, the mutation plasmid sequences were confirmed by sequencing, 17 mutations plusmid; then mutant: wild-type pET28b M MLV and 17 mutant plasmid was transformed into E. coli cells, cultured and induced expression of the mutant enzyme; collect the cell to obtain the mutant enzyme extract; selection of protein expression of the mutant enzyme extract, reverse transcriptase activity screening at different temperatures: the results of activity screening positive mutants in liquid medium, induced protein expression; fermentation purification M MLV reverse transcriptase. Molecular design and rational functional screening combined with the method of the invention, in a smaller range of screening to obtain high thermal stability of M MLV reverse transcriptase, its thermal stability to heat resistance of 65 DEG C.

【技术实现步骤摘要】
一种高性能M-MLV逆转录酶的制备方法
本专利技术涉及一种生物催化剂的制备方法，特别是一种高性能M-MLV逆转录酶的制备方法。
技术介绍
现代生物医学建立在分子生物学“中心法则”的基础之上。通过基因表达研究基因功能是现代生物医学的核心问题之一。由于基因表达产物RNA极易降解，因此绝大多数关于基因表达的研究都需要将RNA逆转录为cDNA来作为研究对象。特别是近年来，伴随着高通量测序技术的飞速发展，RNA测序在生物医学前沿研究中得到了广泛的应用，在真核生物的基因表达调控研究、疾病发生机制研究和精准医疗方案确定、动植物遗传育种等众多方面都具有不可估量的潜力。而RNA测序同样需要首先将模板RNA转变为cDNA来构建测序文库。在这些过程中，都需要一种极为重要的生物催化剂——逆转录酶。逆转录酶（ReverseTranscriptase）是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成cDNA的酶。逆转录酶具有3种活性：RNA指导的DNA聚合酶活性，DNA指导的DNA聚合酶活性（这2种活性共用同一个活性中心），以及降解RNA-DNA杂合链中RNA的RNaseH活性。在生物医学领域，逆转录酶被广泛用于合成第一链cDNA、制备cDNA文库、RNA测序等。为此，最早发现逆转录酶的美国科学家特明（H.M.Temin）和巴尔的摩（D.Baltimore）共同获得了1970年诺贝尔生理学或医学奖。合成cDNA的最大挑战在于，在较低的温度下单链RNA容易自身配对形成发夹等复杂二级结构，阻碍逆转录反应的进行；同时，逆转录酶自身具有的RNaseH活性会降解模板RNA，导致合成的cDNA被截短。而较高的温度能够打开RNA的二级结构，有利于cDNA的合成。目前，人们仍然缺乏高效率热稳定性逆转录酶作为工具，因此，寻找热稳定性更高的逆转录酶，或者改造提升现在已经发现的逆转录酶的热稳定性十分重要。最常用于生物医学工具酶的逆转录酶包括莫洛尼鼠白血病病毒（MoloneyMurineLeukemiavirus，M-MLV）逆转录酶和禽骨髓母细胞瘤病毒（AvianMyeloblastosisVirus，AMV）逆转录酶。M-MLV逆转录酶由一条多肽链构成，包括N端聚合酶结构域和C端RNaseH结构域，一般在37°C-42°C下工作，在高温下会很快失活。AMV逆转录酶具有更高的最适反应温度（45°C-50°C），但由于和M-MLV逆转录酶相比，其cDNA合成效率较低、RNaseH活性较强，所以应用范围较小。由于野生型M-MLV逆转录酶和AMV逆转录酶在反应温度方面受限，科研人员对于它们的热稳定性和cDNA合成效率的提升改造从未间断。其中一个有效的改造是通过点突变将它们的RNaseH活性去除。去除RNaseH活性后，它们对于全长cDNA的合成有了很大改善，热稳定性也有了一定提高。M-MLV逆转录酶由单体构成，结构比AMV逆转录酶（由2个亚基构成）更为简单，因此也得到更多的改造尝试。通过分子设计结合高通量筛选的方法，目前已获得了热稳定性高达60°C的M-MLV逆转录酶突变体。在野生型M-MLV逆转录酶中引入大量随机突变，并使用compartmentalizedribosomedisplay(CRD)evolutioninvitrotechnique技术进行高通量筛选，选出热稳定性提升的突变体。现有报道的最高热稳定性M-MLV逆转录酶耐热能力为60°C。其缺陷在于：由于突变是随机引入的，导致无效突变或失活突变过多，后期筛选工作量大且命中率低。筛选使用的compartmentalizedribosomedisplay(CRD)evolutioninvitrotechnique技术要使用无细胞表达体系，价格昂贵。现有报道的最高热稳定性M-MLV逆转录酶耐热能力为60°C，耐热能力较低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种分子理性设计与功能筛选相结合从而获取高热稳定性的M-MLV逆转录酶的制备方法。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本专利技术是一种高性能M-MLV逆转录酶的制备方法，其特点是，其步骤如下：（1）突变体克隆构建：野生型M-MLV逆转录酶的基因序列CCA64130.1通过基因合成获得，合成至克隆载体pUC57上，产生pUC57-M-MLV质粒；合成序列包括5’端添加的NheI酶切位点和3’端添加的TAA终止密码子以及EcoRI酶切位点；pUC57-M-MLV质粒经NheI和EcoRI双酶切后，带有M-MLV逆转录酶基因的片段以T4DNALigase连接至相同限制性内切酶酶切后的pET-28b载体上，使M-MLV逆转录酶基因的表达框与载体上的组胺纯化标签6xHis的表达框一致；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行质粒扩增，然后提取获得重组质粒pET28b-M-MLV，并经测序确认序列正确；该质粒诱导表达后产生N端融合6xHis纯化标签的M-MLV逆转录酶；逆转录酶突变体的构建以质粒pET28b-M-MLV为原始模板，在突变位点设计特异性引物，使用点突变试剂盒KODSite-DirectedMutagenesisKit定向引入点突变；每轮定向突变只能引入1个单点突变，多点突变的构建经过多轮单点定向突变完成；所构建的突变体质粒序列均经过测序确认，得到17个突变体质粒；（2）突变体的筛选：将编号分别为1-18的野生型pET28b-M-MLV和17个突变体质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)RIPL感受态细胞中，并在含卡那霉素和氯霉素两种抗生素的平板上以30℃－40℃条件培养过夜；挑取平板上的单克隆接种到含卡那霉素和氯霉素两种抗生素的LB液体培养基中，在30℃-40℃、150rpm－250rpm的摇床中活化培养至OD值为0.4－0.6，再加入终浓度为0.1－0.3mM的诱导剂IPTG在16℃下以150rpm－250rpm摇动培养，诱导突变酶表达；IPTG诱导后的发酵液离心收集菌体；菌体以B-PER细菌蛋白提取试剂充分重悬后，静置，涡旋后低温离心取上清，获得突变酶粗提液；对不同突变酶粗提液进行SDS-PAGE电泳检测，观察有无目的蛋白的表达；选择有蛋白表达的突变酶粗提液，在不同温度下进行逆转录活性筛选：以番茄总RNA为模板，进行逆转录反应；向含1µgRNA模板的反应管中按顺序依次加入如下反应组分：1µloligo(dT)20引物、4µl5XM-MLVFirstStrandBuffer、1µl0.1MDTT、1µlRibonucleaseInhibitor、1µldNTPMix，以及0.5µl突变酶粗提液，用Nuclease-freeWater将总体积补至20µl，在37℃－60℃不同反应温度下反应；反应结束后，于80℃－90℃孵育5s－15s以终止反应，使用0.5µl逆转录产物作为PCR模板，并使用高保真KODDNA聚合酶以及1对β-Actin基因的特异性引物进行PCR扩增，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况；观察到PCR扩增条带则认为突变酶粗提液具有逆转录活性；（3）逆转录酶突变体的表达与纯化：将活性筛选结果阳性的突变体在液体培养基中培养至OD值为0.6-0.8，加入终浓度为0.15mM－0.25mM的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高性能M‑MLV逆转录酶的制备方法，其特征在于，其步骤如下：（1）突变体克隆构建：野生型M‑MLV逆转录酶的基因序列CCA64130.1通过基因合成获得，合成至克隆载体pUC57上，产生pUC57‑M‑MLV质粒；合成序列包括5’端添加的NheI酶切位点和3’端添加的TAA终止密码子以及EcoRI酶切位点；pUC57‑M‑MLV质粒经NheI和EcoRI双酶切后，带有M‑MLV逆转录酶基因的片段以T4 DNA Ligase连接至相同限制性内切酶酶切后的pET‑28b载体上，使M‑MLV逆转录酶基因的表达框与载体上的组胺纯化标签6xHis的表达框一致；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行质粒扩增，然后提取获得重组质粒pET28b‑M‑MLV，并经测序确认序列正确；该质粒诱导表达后产生N端融合6xHis纯化标签的M‑MLV逆转录酶；逆转录酶突变体的构建以质粒pET28b‑M‑MLV为原始模板，在突变位点设计特异性引物，使用点突变试剂盒KOD Site‑Directed Mutagenesis Kit定向引入点突变；每轮定向突变只能引入1个单点突变，多点突变的构建经过多轮单点定向突变完成；所构建的突变体质粒序列均经过测序确认，得到17个突变体质粒；（2）突变体的筛选：将编号分别为1‑18的野生型pET28b‑M‑MLV和17个突变体质粒转化进入大肠杆菌BL21 (DE3) RIPL感受态细胞中，并在含卡那霉素和氯霉素两种抗生素的平板上以30℃－40℃条件培养过夜；挑取平板上的单克隆接种到含卡那霉素和氯霉素两种抗生素的LB液体培养基中，在30℃ ‑40℃、150rpm－250 rpm的摇床中活化培养至OD值为0.4－0.6，再加入终浓度为0.1－0.3 mM的诱导剂IPTG在16℃下以150rpm－250 rpm摇动培养，诱导突变酶表达；IPTG诱导后的发酵液离心收集菌体；菌体以B‑PER细菌蛋白提取试剂充分重悬后，静置，涡旋后低温离心取上清，获得突变酶粗提液；对不同突变酶粗提液进行SDS‑PAGE电泳检测，观察有无目的蛋白的表达；选择有蛋白表达的突变酶粗提液，在不同温度下进行逆转录活性筛选：以番茄总RNA为模板，进行逆转录反应；向含1 µg RNA模板的反应管中按顺序依次加入如下反应组分：1 µl oligo(dT)...

【技术特征摘要】
1.一种高性能M-MLV逆转录酶的制备方法，其特征在于，其步骤如下：（1）突变体克隆构建：野生型M-MLV逆转录酶的基因序列CCA64130.1通过基因合成获得，合成至克隆载体pUC57上，产生pUC57-M-MLV质粒；合成序列包括5’端添加的NheI酶切位点和3’端添加的TAA终止密码子以及EcoRI酶切位点；pUC57-M-MLV质粒经NheI和EcoRI双酶切后，带有M-MLV逆转录酶基因的片段以T4DNALigase连接至相同限制性内切酶酶切后的pET-28b载体上，使M-MLV逆转录酶基因的表达框与载体上的组胺纯化标签6xHis的表达框一致；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行质粒扩增，然后提取获得重组质粒pET28b-M-MLV，并经测序确认序列正确；该质粒诱导表达后产生N端融合6xHis纯化标签的M-MLV逆转录酶；逆转录酶突变体的构建以质粒pET28b-M-MLV为原始模板，在突变位点设计特异性引物，使用点突变试剂盒KODSite-DirectedMutagenesisKit定向引入点突变；每轮定向突变只能引入1个单点突变，多点突变的构建经过多轮单点定向突变完成；所构建的突变体质粒序列均经过测序确认，得到17个突变体质粒；（2）突变体的筛选：将编号分别为1-18的野生型pET28b-M-MLV和17个突变体质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)RIPL感受态细胞中，并在含卡那霉素和氯霉素两种抗生素的平板上以30℃－40℃条件培养过夜；挑取平板上的单克隆接种到含卡那霉素和氯霉素两种抗生素的LB液体培养基中，在30℃-40℃、150rpm－250rpm的摇床中活化培养至OD值为0.4－0.6，再加入终浓度为0.1－0.3mM的诱导剂IPTG在16℃下以150rpm－250rpm摇动培养，诱导突变酶表达；IPTG诱导后的发酵液离心收集菌体；菌体以B-PER细菌蛋白提取试剂充分重悬后，静置，涡旋后低温离心取上清，获得突变酶粗提液；对不同突变酶粗提液进行SDS-PAGE电泳检测，观察有无目的蛋白的表达；选择有蛋白表达的突变酶粗提液，在不同温度下进行逆转录活性筛选：以番茄总RNA为模板，进行逆转录反应；向含1µgRNA模板的反应管中按顺序依次加入如下反应组分：1µloligo(dT)20引物、4µl5XM-MLVFirstStrandBuffer、1µl0.1MDTT、1µlRibonucleaseInhibitor、1µldNTPMix，以及0.5µl突变酶粗提液，用Nuclease-freeWater将总体积补至20µl，在37℃－60℃不同反应温度下反应；反应结束后，于80℃－90℃孵育5s－15s以终止反应，使用0.5µl逆转录产物作为PCR模板，并使用高保真KODDNA聚合酶以及1对β-Actin基因的特异性引物进行PCR扩增，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况；观察到PCR扩增条带则认为突变酶粗提液具有逆转录活性；（3）逆转录酶突变体的表达与纯化：将活性筛选结果阳性的突变体在液体培养基中培养至OD值为0.6-0.8，加入终浓度为0.15mM－0.25mM的IPTG，在15℃－17℃，180rpm－220rpm培养10－20小时，诱导蛋白表达；将IPTG诱导后的发酵液以8000g离心15－25min收集菌体；菌体以Ni柱结合缓冲液充分重悬后，以细胞高压破碎仪破碎，再以43000g低温离心20－40min，取上清以Ni亲和层析纯化柱纯化并分步收集，将单管收集的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测；Ni亲和层析过程中使用的缓冲液包括：平衡缓冲液、漂洗缓冲液和梯度洗脱缓冲液；Ni亲和层析的洗脱峰以AKTA系统配套Superdex200层析柱进行分子筛层析，收集洗脱峰并透析至贮存缓冲液，储存于-80°C；整个纯化过程在冰上或4°C进行；得到M-MLV逆转录酶。2.根据权利要求1所述的高性能M-MLV逆转录酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）突变体的筛选：将编号分别为1-18的野生型pET28b-M-MLV和17个突变体质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)RIPL感受态细胞中，并在含75µg/ml卡那霉素和35µg/ml氯霉素两种抗生素的平板上以37°C条件培养过夜；挑取平板上的单克隆接种到含75µg/ml卡那霉素和35µg/ml氯霉素两种抗生素的10mlLB液体培养基中，在37°C，200rpm的摇床中活化培养至OD值为0.4-0.6，再加入终浓度为0.2mM的诱导剂IPTG在16°C下以200rpm摇动培养16小时，诱导突变酶表达；IPTG诱导后的发酵液以8000g离心5min收集菌体；菌体以2mlB-PER细菌蛋白提取试剂充分重悬后，22°C静置15min，涡旋1min后以18000g低温离心5min取上清，获得突变酶粗提液；对不同突变酶粗提液进行SDS-PAGE电泳检测，观察有无目的蛋白的表达；选择有蛋白表达的突变酶粗提液，在不同温度下进行逆转录活性筛选：以番茄总RNA为模板，进行逆转录反应；向含1µgRNA模板的反应管中按顺序依次加入如下反应组分：50µM的1µloligo(dT)20引物；组成为250mMTris-HCl,pH8.3,375mMKCl,15mMMgCl2的4µl5XM-MLVFirstStrandBuffer；1µl0.1MDTT；40U/µl的1µlRibonucleaseInhibitor；10mMeach的1µldNTPMix，以及0.5µl突变酶粗提液，用Nuclease-freeWater将总体积补至20µl...

【专利技术属性】
技术研发人员：李京，高嵩，陈祉月，罗志丹，龚雪梅，张惠铭，张羽，潘绮雯，
申请(专利权)人：淮海工学院，江苏愚公生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32