基因编码的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸基因编码荧光探针及其制备方法和应用。一方面，本发明专利技术涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的检测探针，具体涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组荧光融合蛋白检测探针。在一个具体方面，本发明专利技术涉及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的重组荧光融合蛋白检测探针；在另一个具体方面，本发明专利技术涉及氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的重组荧光融合蛋白检测探针；在又一方面，本发明专利技术涉及还原型和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比率的重组荧光融合蛋白检测探针。本发明专利技术也涉及上述检测探针的制备方法及其分别在检测NADH、NAD+和NADH/NAD+比率中的应用。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号201110288807.6，申请日为2011年9月26日，名为“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸基因编码荧光探针及其制备方法和应用”的专利技术专利申请的分案申请。母案的全部内容在此通过引用全文纳入本文用于所有目的。
本专利技术涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的检测探针，具体涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组荧光融合蛋白检测探针。在一个具体方面，本专利技术涉及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的重组荧光融合蛋白检测探针；在另一个具体方面，本专利技术涉及氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的重组荧光融合蛋白检测探针；在又一方面，本专利技术涉及还原型和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比率的重组荧光融合蛋白检测探针。本专利技术也涉及上述检测探针的制备方法及其分别在检测NADH、NAD+和NADH/NAD+比率中的应用。
技术介绍
NAD+及NADH作为辅酶，是呼吸链的重要组成部分，它参与了呼吸链中的电子传递过程(Rich,P.R.等，Biochem Soc Trans.2003，V.31(6)，pp.1095-1105)。在呼吸链的氧化还原反应中，NAD+作为质子的载体，当其接受了其他分子传递过来的一个电子后，由最初的氧化态转变为还原态，该反应的最终产物为NADH，而NADH可以作为还原剂向其他分子提供电子(Belenky,P.等，Trends in Biochemical Sciences.2007,V.32(1),pp.12-19)。近来的研究表明，NAD(H)不仅参与能量代谢、物质合成以及抗氧化作用，还涉及到体内的钙稳态、基因表达、免疫作用以及细胞衰老与死亡等等，而NAD(H)在其中均有着至关重要的作用，因此NAD(H)本身及其代谢所涉及的众多酶类也成为了药物设计的靶标(Sauve,A.A.等，J Pharmacol Exp Ther.2008,V.324(3),pp.883-893)。但是，大多数活细胞内的NAD(H)的总量大约为10-6M～10-3M，而且NAD+/NADH的比例也随着细胞内状态不同而不尽相同(Lin,S.J.等,Current Opinion in Cell Biology.2003,V.15(2),pp.241-246)，因此这给NAD(H)的测定带来了极大的不便。较早的检测方法主要是利用NADH在340nm紫外光区有特征吸收，由此建立了紫外分光光度法，该方法存在两个主要的缺陷：1、有效灵敏度受仪器精密度所限，约为10-7M；2、在复杂体系中，不能有效地区分NADH与NADPH。随后，根据NAD+作为辅酶，在电子传递过程中接受电子转变为NADH的特性，发展出了一系列酶学检测方法。其他如HPLC分析、电化学法、毛细管电泳、荧光成像等方法也常见诸于各种文献报道中。然而，大部分的方法或者对单个细胞中靶标分子的灵敏度不足，或者不能进行亚细胞器定位。特别需要指出的是，这些现有方法均存在一个主要的缺陷，即需要对样品进行裂解、分离、纯化等操作，而NADH本身又极易氧化，在一系列繁琐的操作中极易将误差引入，导致最终显示的结果与实际存在出入。另外，这些现有方法不能应用于活体动物或细胞，不能进行实时地检测，这限制了这些方法在临床疾病诊断及药物前体研究等邻域的应用。目前在活体或细胞上只能采用NADH自发荧光来检测(Zhang,Q.H.等，Science.2002，V.295(5561)，pp.1895-1897)，而这种传统方法存在以下严重缺陷：首先，已知细胞对NAD+/NADH和NADP+/NADPH的调控是相对独立的，正常状态下NAD+/NADH的比例大约在700:1，而NADP+/NADPH的比例在1:200；其次，它们的氧化还原势存在着巨大的区别，这反映出NADH与NADPH分别在能量代谢与合成代谢中扮演截然不同的角色；第三，NADH与NADPH自发荧光完全不可区分，利用自发荧光进行成像测量获得的结果是NADH与NADPH之和，鉴于NADH含量很低且大部分以蛋白质结合形式存在，所以NADH自发荧光数据实质反映的是蛋白质结合的NADPH的浓度(Zhang，Q.H.等，Science.2002，V.295(5561)，pp.1895-1897)；第四，由于NADH激发波长位于紫外区(340nm)且自发荧光较弱，需要复杂昂贵的仪器如用于临床监测的仪器CritiView，再加上紫外光对组织的穿透力很弱并会造成细胞损伤，这些光学特性严重制约了自发荧光监测的应用。因此，本领域亟需发展一种特异性NADH检测技术，特别是一种适合生理水平和亚细胞水平的特异性NADH检测技术。而相对于传统的小分子染料检测技术以及迅速发展的量子点检测技术，荧光蛋白检测技术在大多数的活体细胞成像方面具有独一无二的压倒性优势，它能够通过遗传导入至细胞、组织乃至整个器官中，因此荧光蛋白能够作为一个全细胞标记物或基因启动激活的指示器。绿色荧光蛋白最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)中提取，野生型的AvGFP由238个氨基酸构成，分子量约为26kD。当前的研究确认，天然GFP蛋白中第65～67位的三个氨基酸Ser-Tyr-Gly能够自发形成一个荧光生色基团：对-羟基苯亚甲基咪唑啉酮(p-hydroxybenzylideneimidazolinone)，是其主要的发光位置。野生型AvGFP的光谱特征十分复杂，其荧光激发的主峰在395nm处，而在475nm处另有一个附峰，后者振幅强度约为前者的1/3。在标准的溶液条件下，395nm处的激发可产生508nm处的发射，而475nm处的激发产生的最大发射波长位于503nm(Heim，R.等，Proc Natl Acad Sci U S A.1994，V.91(26)，pp.12501-12504)。随着对GFP蛋白突变的研究日渐深入，利用分子生物学技术，目前已经发展出多种表现突出的GFP衍生物，通过在野生型GFP基础上进行不同的单点突变或者组合，可获得诸如增强型GFP(S65T，F64L)、YFP(T203Y)、CFP(Y66W)等。而借助对GFP蛋白序列的重新排列，将原第145-238位氨基酸部分作为新蛋白的N端，原第1-144位氨基酸作为新蛋白的C端，两片段间通过一小段具有柔性的短肽链连接，形成一个对空间变化敏感的环状排列荧光蛋白(circular permutation fluorescent protein)，在此基础上对原蛋白T203Y进行的点突变就形成了环状排列的黄色荧光蛋白cp本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种遗传编码的荧光探针，其内含有(1)对环境内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感的多肽，和(2)通过光谱性质的改变对环境内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸进行表现的部分，该部分是荧光蛋白序列或其衍生物，其中，所述荧光探针可以探测氧化型或还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或探测氧化型与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的比率。

【技术特征摘要】
1.一种遗传编码的荧光探针，其内含有
(1)对环境内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸敏感的多肽，和
(2)通过光谱性质的改变对环境内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸进行表现的部分，
该部分是荧光蛋白序列或其衍生物，
其中，所述荧光探针可以探测氧化型或还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或
探测氧化型与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的比率。
2.如权利要求1所述的遗传编码的荧光探针，所述荧光探针的氨基酸序列选
自序列表中的序列31-42，即中国专利申请201110288807.6中SEQ ID NO：128-133
或144-149中的一种。
3.一种核酸序列，其核苷酸序列编码权利要求1或2所述的荧光探针。
4.一种核酸序列，所述核酸序列与权利要求3所述的核酸序列互补。
5.一种表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨弋，赵玉政，呼庆勋，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31