改善目标多核苷酸相对于跨膜孔移动的方法技术

本发明专利技术涉及当目标多核苷酸相对于跨膜孔的移动由多核苷酸结合蛋白控制时，改善所述移动。本发明专利技术还涉及改善的跨膜孔和多核苷酸结合蛋白。

Method for improving the movement of a target polynucleotide with respect to a transmembrane pore

The present invention relates to a method for improving the movement of a target polynucleotide relative to a transmembrane pore when controlled by a polynucleotide binding protein. The invention also relates to improved transmembrane pores and polynucleotide binding proteins.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种当目标多核苷酸相对于跨膜孔的移动由多核苷酸结合蛋白控制时，改善所述移动。本专利技术还涉及改善的跨膜孔和多核苷酸结合蛋白。
技术介绍
目前需要涉及广泛应用范围的快速且廉价的多核苷酸(例如DNA或RNA)测序和鉴别技术。现有技术缓慢且昂贵，主要是因为它们依靠扩增技术来产生大量的多核苷酸，并且需要大量的专门的荧光化学物质用于信号检测。跨膜孔(纳米孔)具有作为用于聚合物和各种小分子的直接的电生物传感器的巨大潜力。特别地，作为潜在DNA测序技术的纳米孔已成为最近焦点。当跨越纳米孔施加电势时，当分析物(例如核苷酸)在桶状体中短暂驻留一段时间后，电流发生变化。核苷酸的纳米孔检测给出了已知标记和持续时间的电流变化。在链测序方法中，使单个多核苷酸链穿过孔，得到对核苷酸的鉴别。链测序可以包括使用多核苷酸结合蛋白来控制多核苷酸穿过孔的运动。Msp的不同形式是来自耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的孔蛋白。MspA为来自耻垢分枝杆菌的157kDa八聚体孔蛋白。野生型MspA不以允许DNA被表征或被测序的方式与DNA相互作用。MspA的结构以及其与DNA相互作用并表征DNA所需的修饰已有大量文献记载(Butler，2007，核酸的纳米孔分析，哲学博士论文，华盛顿大学；Gundlach，ProcNatlAcadSciUSA.2010年9月14；107(37)：16060-5.Epub2010年8月26；以及国际申请No.PCT/GB2012/050301(公开号为WO/2012/107778)。
技术实现思路
令人惊讶地，本专利技术人已证明，通过修饰跨膜孔的与多核苷酸结合蛋白相互作用的部分和/或多核苷酸结合蛋白的与跨膜孔相互作用的部分，改善了由多核苷酸结合蛋白控制的目标多核苷酸相对于跨膜孔的移动。因此，本专利技术提供了一种当目标多核苷酸相对于跨膜孔的移动由多核苷酸结合蛋白控制时，改善所述移动的方法，包括修饰跨膜孔的与多核苷酸结合蛋白相互作用的部分和/或多核苷酸结合蛋白的与跨膜孔相互作用的部分，从而改善目标多核苷酸相对于跨膜孔的移动。本专利技术还提供了：-一种使用多核苷酸结合蛋白使目标多核苷酸相对于跨膜孔移动的方法，包括a)提供跨膜孔和多核苷酸结合蛋白，其中跨膜孔的与多核苷酸结合蛋白相互作用的部分和/或多核苷酸结合蛋白的与跨膜孔相互作用的部分已被修饰；以及b)使a)中提供的跨膜孔及多核苷酸结合蛋白与目标多核苷酸接触，使得蛋白质控制多核苷酸相对于跨膜孔的移动；-一种表征目标多核苷酸的方法，包括：a)提供跨膜孔和多核苷酸结合蛋白，其中跨膜孔的与多核苷酸结合蛋白相互作用的部分和/或多核苷酸结合蛋白的与跨膜孔相互作用的部分已被修饰；b)使a)中提供的跨膜孔及多核苷酸结合蛋白与目标多核苷酸接触，使得蛋白质控制多核苷酸相对于跨膜孔的移动；以及c)获取多核苷酸相对于跨膜孔移动时的一个或多个测量值，其中所述测量值表示多核苷酸的一个或多个特征，从而表征目标多核苷酸；-一种跨膜孔，其中跨膜孔的与多核苷酸结合蛋白相互作用的部分已被修饰；-一种突变体Msp单体，包括SEQIDNO：2的变体，其中所述单体的与多核苷酸结合蛋白相互作用的部分已被修饰；-一种构建体，包括两个或更多个共价连接的MspA单体，其中至少一个所述单体为本专利技术的突变体单体；-一种衍生自Msp的同源寡聚孔，包括本专利技术的相同突变体单体或本专利技术的相同构建体；-一种衍生自Msp的异源寡聚孔，包括至少一个本专利技术的突变体单体或至少一个本专利技术的构建体；-一种多核苷酸结合蛋白，其中蛋白质的与跨膜孔相互作用的部分已被修饰；-一种跨膜孔与多核苷酸结合蛋白的组合，其中跨膜孔的与多核苷酸结合蛋白相互作用的部分和/或多核苷酸结合蛋白的与跨膜孔相互作用的部分已被修饰；-一种表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)本专利技术的跨膜孔，和(b)膜的组分；-一种表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)本专利技术的多核苷酸结合蛋白，和(b)多核苷酸结合蛋白可选地结合的多核苷酸适配体；-一种表征样本中目标多核苷酸的设备，包括(a)本专利技术的多个跨膜孔或本专利技术的多个组合，和(b)多个膜；以及-一种表征目标多核苷酸的方法，包括：a)提供跨膜孔和聚合酶，其中跨膜孔的与聚合酶相互作用的部分和/或聚合酶的与跨膜孔相互作用的部分已被修饰；b)使目标多核苷酸与a)中提供的跨膜孔及聚合酶以及标记的核苷酸接触，使得磷酸盐标记的物质被聚合酶顺序添加至目标多核苷酸，其中磷酸盐物质含有对每个核苷酸特异性的标记；以及c)使用跨膜孔检测磷酸盐标记的物质，从而表征多核苷酸。附图说明图1示出了T4Dda–E94C/A360C/C109A/C136A(具有突变E94C/A360C/C109A/C136A以及(ΔM1)G1G2的SEQIDNO：24)相对于MspA-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D118R/Q126R/D134R/E139K)8(具有突变G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D118R/Q126R/D134R/E139K的SEQIDNO：2＝MspA突变体1)或MspA–((Del-L74/G75/D118/L119)D56N/E59R/L88N/D90N/D91N/Q126R/D134R/E139K)8(具有突变D56N/E59R/L88N/D90N/D91N/Q126R/D134R/E139K并缺失氨基酸L74/G75/D118/L119的SEQIDNO：2＝MspA突变体2)的三种不同初始模拟取向。泳道1(run1)与泳道2之间的差异在于，虽然孔和酶处于相同的位置，但酶和孔的侧链构象不同。在泳道3中，酶相对于纳米孔略微倾斜。图2示出了纳米孔MspA突变体1与T4Dda–E94C/A360C/C109A/C136A的相互作用点的绘图(y轴坐标＝孔/酶接触数量，x轴坐标＝孔氨基酸残基数量)。绘图的每一行示出了不同酶/纳米孔取向的相互作用点，例如，泳道1-3。图3示出了酶T4Dda–E94C/A360C/C109A/C136A与MspA突变体1的相互作用点的绘图(y轴坐标＝孔/酶的接触数量，x轴坐标＝酶氨基酸残基数量)。绘图的每一行示出了不同酶/纳米孔取向的相互作用点，例如，泳道1-3。图4示出了纳米孔MspA突变体2与T4Dda–E94C/A360C/C109A/C136A的相互作用点的绘图(y轴坐标＝孔/酶的接触数量，x轴坐标＝孔氨基酸残基数量)。绘图的每一行示出了不同酶/纳米孔取向的相互作用点，例如，泳道1-3。图5示出了酶T4Dda–E94C/A360C/C109A/C136A与MspA突变体2的相互作用点的绘图(y轴坐标＝孔/酶的接触数量，x轴坐标＝酶氨基酸残基数量)。绘图的每一行示出了不同酶/纳米孔取向的相互作用点，例如，泳道1-3。图6(A)示出了绘图(y轴坐标＝孔氨基酸残基数量，x轴坐标＝酶氨基酸残基数量)的两个区域，该绘图示出了来自泳道1的孔(MspA突变体2)中氨基酸与酶(T4Dda–E94C/A360C/C109A/C136本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种当目标多核苷酸相对于跨膜孔的移动由多核苷酸结合蛋白控制时，改善所述移动的方法，包括，修饰所述跨膜孔的与所述多核苷酸结合蛋白相互作用的部分和/或所述多核苷酸结合蛋白的与所述跨膜孔相互作用的部分，从而提高所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔的移动。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.02 GB 1407809.1;2014.10.07 GB 1417708.3;201.一种当目标多核苷酸相对于跨膜孔的移动由多核苷酸结合蛋白控制时，改善所述移动的方法，包括，修饰所述跨膜孔的与所述多核苷酸结合蛋白相互作用的部分和/或所述多核苷酸结合蛋白的与所述跨膜孔相互作用的部分，从而提高所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔的移动。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法提供了所述目标多核苷酸的更为一致的移动。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法降低了与所述目标多核苷酸的移动相关的噪声。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述目标多核苷酸为双链多核苷酸，并且其中与互补链的移动相关的噪声被所述方法降低的程度大于与模板链的移动相关的噪声被所述方法降低的程度，和/或所述互补链的移动的一致性被所述方法提高的程度大于所述模板链的移动的一致性被所述方法提高的程度。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述跨膜孔及所述多核苷酸结合蛋白与所述目标多核苷酸接触，使得所述蛋白质控制所述多核苷酸相对于所述跨膜孔的移动。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括，对与所述多核苷酸结合蛋白相互作用的所述跨膜孔的表面进行一个或多个修饰，和/或对与所述跨膜孔相互作用的所述多核苷酸结合蛋白的表面进行一个或多个修饰。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括，对与所述多核苷酸结合蛋白相互作用的所述跨膜孔的入口进行一个或多个修饰。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括，进行一个或多个修饰，所述修饰改变所述跨膜孔的与所述多核苷酸结合蛋白相互作用的部分的电荷、空间位阻、氢键、π键堆叠或结构，和/或所述多核苷酸结合蛋白的与所述跨膜孔相互作用的部分的电荷、空间位阻、氢键、π键堆叠或结构。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括，进行一个或多个修饰，所述修饰减少所述跨膜孔的与所述多核苷酸结合蛋白相互作用的部分的净负电荷。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述一个或多个修饰为，使用一个或多个带正电荷、不带电荷、非极性和/或芳香族的氨基酸缺失一个或多个带负电荷的氨基酸或取代一个或多个带负电荷的氨基酸。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括，修饰跨膜孔，所述跨膜孔包括七个或更多个包含SEQIDNO：2或其变体中所示序列的单体。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述跨膜孔的与所述多核苷酸结合蛋白相互作用的部分包括下列位置的氨基酸：(a)SEQIDNO：2中的位置12、14、48、52、53、54、55、56、57、58、59、60、134、135、136、137、138、139、169和170，或SEQIDNO：2的变体中的对应位置；(b)SEQIDNO：2中的位置12、14、52、54、56、57、59、134、136、138、139和169，或SEQIDNO：2的变体中的对应位置；(c)SEQIDNO：2中的位置12、14、56、57、59、134、136、139和169，或SEQIDNO：2的变体中的对应位置；(d)SEQIDNO：2中的位置56、57、59、134、136、139和169，或SEQIDNO：2的变体中的对应位置；或(e)SEQIDNO：2中的位置56、57、59、134和139，或SEQIDNO：2的变体中的对应位置。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法包括修饰所述七个或更多个单体中的一个或多个，使得它们在SEQIDNO：2的位置56、57、59、134和139中的一个或多个位置，或SEQIDNO：2的变体的一个或多个对应位置不包括天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。14.根据权利要求13所述的方法，所述方法包括修饰所述七个或更多个单体中的一个或多个，使得它们包括以下中的一个或多个：(a)D56N或D56R，(b)E57N或E57R，(c)E59N或E59R，(d)D134N或D134R，及(e)E139N、E139R或E139K。15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中SEQIDNO：2的变体包括D90N、D91N、D118R、D134R和E139K，并可选地包括D93N，或包括(a)L88N、D90N、D91N、D93N、D118R、D134R和E139K，(b)G75S、G77S、L88N、D90N、D91N、D93N、D118R、Q126R、D134R和E139K，或(c)G75S、G77S、L88N、D90N、D91N、D118R、Q126R、D134R和E139K。16.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中在SEQIDNO：2的变体中，(a)SEQSEQIDNO:2的位置72至82处的2，4，6，8或10个已缺失，且(b)SEQIDNO：2的位置111至121处的2，4，6，8或10个氨基酸已缺失。17.根据权利要求11至16中任一项所述的方法，其中所述被修饰的跨膜孔不包含一个或多个这样的单体：所述单体为SEQIDNO：2的变体，并包含E59R、D90N、D91N、D93N、D118R、D134R和E139K或由其组成。18.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述方法包括修饰跨膜孔，所述跨膜孔包括含有SEQIDNO：4或其变体中所示序列的七个单体。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述所述跨膜孔的与所述多核苷酸结合蛋白相互作用的部分包括位于下列位置的氨基酸：(a)SEQIDNO：4中的位置16，17，18，19，21，46，47，93，236，237，238，239，240，241，242，281，283，285，287，288和293，或SEQIDNO：4的变体中的对应位置；(b)SEQIDNO：4中的位置17，18，19，46，47，93，236，237，238，239，240，241，242，287，288和293，或SEQIDNO：4的变体中的对应位置；(c)SEQIDNO：4中的位置17，19，46，47，93，236，237，238，239，240，241，242和287，或SEQIDNO：4的变体中的对应位置；或(d)SEQIDNO：4中的位置17，19，46，93，236，237，239，240，287和288，或SEQIDNO：4的变体中的对应位置。20.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述方法包括修饰跨膜孔，所述跨膜包括含有SEQIDNO：36或其变体中所示序列的至少一个单体。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述所述跨膜孔的与所述多核苷酸结合蛋白相互作用的部分包括，SEQIDNO：36的位置31，33，108，109，110和138的氨基酸或SEQIDNO：36的变体的对应位置的氨基酸。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括修饰多核苷酸结合蛋白，所述多核苷酸结合蛋白包括SEQIDNO：24或其变体中所示的序列。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述多核苷酸结合蛋白的与所述跨膜孔相互作用的所述部分包括位于下列位置的氨基酸：(a)SEQIDNO：24中的位置1，2，3，4，5，6，51，176，177，178，179，180，181，185，189，191，193，194，195，197，198，199，200，201，202，203，204，207，208，209，210，211，212，213，216，219，220，221，223，224，226，227，228，229，247，254，255，256，257，258，259，260，261，298，300，304，308，318，319，321，337，347，350，351，405，415，422，434，437，438，或SEQIDNO：24的变体中的对应位置；(b)SEQIDNO：24中的位置1，2，4，51，177，178，179，180，185，193，195，197，198，199，200，202，203，204，207，208，209，210，211，212，216，221，223，224，226，227，228，229，254，255，256，257，258，260，3...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉科马·贾亚辛格，伊丽莎白·杰恩·华莱士，乔纳森·班克兹·皮尤，理查德·乔治·汉布利，尼尔·罗杰·伍德，克莱夫·加文·布朗，詹姆斯·怀特，
申请(专利权)人：牛津纳米孔技术公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB