本发明专利技术公开了一种溶血素融合蛋白PeLa‑EK‑10His‑SLO及其表达质粒与应用，属于医学微生物或生物制药领域。本发明专利技术在大肠杆菌中表达了该溶血素融合蛋白PEHSLO，发现该溶血素融合蛋白PEHSLO表达量提高且对宿主细胞毒性低。溶血素融合蛋白PEHSLO同时具有果胶酶活性、溶血性和SLO抗原性，该工程菌果胶酶产率为5.6Unit/mL培养液，溶血酶产率为400000Unit/mL，可溶性溶血素融合蛋白PEHSLO产率为1.2mg/mL培养液。在生产监控检测方面，溶血素融合蛋白PEHSLO可以用果胶酶活性进行定性和定量分析，避免使用免疫学和溶血法检测，简化了检测方法、缩短了检测时间、节约了检测成本。溶血素融合蛋白PEHSLO还可以应用于溶血素蛋白SLO生产、SLO抗体制品生产、SLO抗体检测试剂生产或抗癌药物生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种溶血素融合蛋白PeLa-EK-IOHis-SLO及其表达质粒与应用，属于 医学微生物或生物制药领域。
技术介绍
化脓链球菌是一类常见的细菌，可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感 染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小 球肾炎等变态反应。 化脓链球菌的溶血素（Str印tolysin 0, SL0)能够与人及其它动物的细胞膜上 的胆固醇相结合，结合到细胞膜上的SLO蛋白会形成环状寡聚体，形成大的孔道，导致细 胞膜溶解，另外，SLO具有极强的抗原性且易在体内残留，刺激人体及其它动物产生抗体 (anti-SLO, AS0)，ASO集聚，导致变态反应。 SLO作为检测试剂，可以用来检测患者体内的ASO ;其次，可以作为治疗肿瘤和杀 死肿瘤细胞的药物，另外，SLO作为成孔蛋白，在动物基因工程和蛋白工程领域，用作动物细 胞转基因和转蛋白工具。 目前SLO蛋白的基因工程重组技术主要存在以下缺陷：SLO蛋白对宿主具有毒性， 表达量低和生产过程中SLO检测方法相对繁琐。
技术实现思路
本专利技术针对SLO重组蛋白对宿主具有毒性，表达量低和SLO蛋白检测相对繁琐的 问题，提供了一种溶血素融合蛋白PeLa-EK-IOHis-SLO及其表达质粒与应用。 本专利技术的第一个目的是提供了 一种溶血素融合蛋白（PeLa-EK-IOHi s-SLO， PEHSL0)，该溶血素融合蛋白PEHSLO具有果胶酸裂解酶和溶血素蛋白活性；PHlSLO内部有 肠激酶的酶切位点，可以根据需要切除果胶酸裂解酶；另外，还含有10个组氨基酸序列，为 蛋白纯化提供有效的亲和基团。 所述溶血素融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列。 编码所述溶血素融合蛋白的溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo,可在大肠杆菌 中高效表达溶血素融合蛋白PEHSL0。 所述溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo的核苷酸序列，在本专利技术的一种实施 方式中，如SEQ ID NO. 2所示。 所述npela-ek-10his-slo的核苷酸序列，在本专利技术的一种实施方式中，使用了曲 霉果胶酸裂解酶酶活性区Pela序列、大肠杆菌肠激酶位点序列、10个组氨基酸和化脓链球 菌溶血素 slo活性区与抗原区序列。而且曲霉果胶酸裂解酶酶活性区pela序列和化脓链 球菌溶血素 slo活性区与抗原区序列，依据大肠杆菌背景下的密码子优化和增加蛋白表明 基团亲水性等原理，进行了优化设计。 本专利技术的第二个目的是提供一种表达所述溶血素融合蛋白PEHSLO或使用所述 npela-ek-10his-slo融合基因构建的表达质粒。 所述质粒，在本专利技术的一种实施方式中，为npela-ek-10his-sl〇-pET_28a(+)，其 核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。 本专利技术的第三个目的是提供一种表达所述溶血素融合蛋白PEHSLO的基因工程菌 或转基因细胞系。 所述基因工程菌，在本专利技术的一种实施方式中，以大肠杆菌BL21(DE3)为 宿主，pET-28a⑴为载体，表达核苷酸序列为SEQ ID NO. 2的溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo〇 本专利技术的第四个目的是提供一种检测溶血素 SLO的方法，所述方法是融合表达果 胶酸裂解酶和溶血素蛋白，通过检测果胶酶活性定性和定量分析溶血素 SL0。所述融合表达 是融合表达编码氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的基因。 本专利技术的第五个目的是提供一种提高SLO可溶性表达的方法。所述方法是以大肠 杆菌BL21(DE3)为宿主，pET-28a(+)为载体，表达核苷酸序列为SEQ ID NO. 2的溶血素融 合基因 npela-ek-10his-slo。 本专利技术还要求保护所述溶血素融合蛋白PEHSLO在SLO蛋白生产、SLO检测、SLO抗 体制品制备、抗癌药物生产、基因工程或蛋白工程等领域的应用。 本专利技术的有益效果： (1)本专利技术设计并合成了溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo,构建了含该 npela-ek-lOhis-slo融合基因的表达质粒和含该表达质粒的工程菌，该工程菌可以表达溶 血素融合蛋白（PeLa-EK-10His-SL0，PEHSL0)。摇瓶发酵表达结果表明，溶血素融合蛋白 PEHSLO对宿主细胞毒性低，20°C条件下表达48h后，npela-ek-10his-slo工程菌0D600可 以达到2. 5,高于slo独立表达的工程菌（0D600 :1.60);说明融合表达可以降低SLO蛋白对 宿主具有毒性。 (2)本专利技术的工程菌表达的溶血素融合蛋白PEHSLO同时具有果胶酶活性、溶血性 和SLO抗原性；该工程菌果胶酶产率为5. 6Unit/mL培养液，溶血酶产率为400000Unit/mL， 可溶性溶血素融合蛋白PEHSLO产率为I. 2mg/mL培养液，占到细胞总蛋白的30 %，相比slo 胞内独立表达（可溶性目标蛋白占胞内蛋白的5% )，可溶性目标蛋白产量上升达400% ; 说明融合表达可以提尚SLO蛋白的表达量。 (3)在生产监控检测方面，溶血素融合蛋白PEHSLO可以用果胶酶活性进行定性和 定量分析，一次果胶酶检测所需时间为〇. 3h，检测成本为0. 15元人民币，避免使用免疫学 (一次检测所需时间为l〇h，检测成本为500. 00元人民币）和溶血法检测（一次检测所需 时间为I. 〇h，检测成本为0. 50元人民币），相对于经测定免疫学和溶血法检测，检测时间分 别缩短9. 5h和0. 5h，检测成本分别节省499. 85元和0. 35元人民币，经测定IUnit果胶酶 活性对应于0. 2mg左右的蛋白量和7. OX IO4Unit溶血酶活性。本专利技术的方法可以简便SLO 的检测，缩短检测时间、降低检测成本。【附图说明】 图 1 :设计的 npela-ek-10his-sl〇-pET_28a(+)质粒结构图； 图 2 :npela-ek-10his-slo/pET_28a(+)酶切鉴定图；I. DNA Marker， 2. npela-ek-10his-slo/pET_28a，3. npela-ek-10his-slo/pET_28a (+)双酶切； 图 3 :重组表达 Pela-EK-IOHis-SLO 的 SDS-PAGE 图谱；1.蛋白 Marker， 2. npela-slo/pET28a(+)/BL21 (DE3)的胞内上清，3.纯化的 Pela-EK-10His-SL0。【具体实施方式】 以下通过实施例来进一步阐明本专利技术，下列实施例用于说明目的而非用于限制本 专利技术范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册 所述的条件进行操作。 实施例1溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo设计与表达质粒设计 所述核苷酸序列使用了曲霉果胶酸裂解酶酶活性区pela序列、大肠杆菌肠激酶 位点序列、10个组氨基酸和化脓链球菌溶血素 Slo活性区与抗原区序列，而且曲霉果胶酸 裂解酶酶活性区pela序列和化脓链球菌溶血素 Sl0活性区与抗原区序列，依据大肠杆菌背 景下的密码本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种溶血素融合蛋白PEHSLO，其特征在于，所述溶血素融合蛋白PEHSLO含果胶酸裂解酶和溶血素蛋白序列；编码所述果胶酸裂解酶和溶血素蛋白的氨基酸序列之间还含有肠激酶酶切位点序列和10个组氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵庆新，王建，崔刚，王欢莉，康贻军，沈敏，
申请(专利权)人：盐城师范学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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