本发明专利技术公开了具有改善的溶解性和/或半衰期而仍然保持胰高血糖素激动剂活性的修饰的胰高血糖素肽。通过将原始氨基酸替换为带电的氨基酸和/或向肽的羧基末端添加带电的氨基酸对胰高血糖素肽进行修饰。可以通过聚乙二醇化或通过添加选自SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23的羧基末端肽或通过这二者对修饰的胰高血糖素激动剂进行进一步修饰，以进一步增强胰高血糖素激动剂类似物的溶解性。
【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2009年6月16日、专利技术名称为“在生理pH缓冲液中具有增强的溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物”、申请号为200980127066.4的专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求下列优先权：2008年6月17日提交的美国临时专利申请号61/073,193，2008年7月3日提交的美国临时专利申请号61/078,165和2008年8月20日提交的美国临时专利申请号61/090,415。每个申请的公开内容均明确地通过引用的方式全文并入本文。
本专利技术涉及在生理pH缓冲液中具有增强的溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物。
技术介绍
前胰高血糖素原(pre-proglucagon)是158个氨基酸的前体多肽，其在不同组织中被处理以形成多个不同的胰高血糖素原衍生的肽，包括胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-1)和胃泌酸调节素(OXM)，它们参与众多生理学功能，包括葡萄糖体内平衡、胰岛素分泌、胃排空和肠生长，以及食物摄入的调节。胰高血糖素是29个氨基酸的肽，其对应于前胰高血糖素原的氨基酸33至61，而GLP-1作为37个氨基酸的肽产生，其对应于前胰高血糖素原的氨基酸72至108。当血糖水平降得太低以致于不能为身体活动提供足够能量时，发生低血糖症。在成人或10岁以上的儿童中，低血糖症较不常见，除非是作为糖尿病治疗的副作用，但是它可以来源于其它药物治疗或疾病、激素或酶缺乏、或肿瘤。当血糖开始下降时，由胰腺产生的激素胰高血糖素向肝脏发出信号，使肝脏分解肝糖原并释放葡萄糖，使血糖水平朝着正常水平升高。因此，普遍认为胰高血糖素在葡萄糖调节中的作用是抵消胰岛素的作用并维持血糖水平。但是对于糖尿病而言，这种针对低血糖症的胰高血糖素响应可能被破坏，使葡萄糖水平难以恢复至正常范围。低血糖症是威胁生命的事件，其需要立即进行医疗关注。给予胰高血糖素是已经建立起来的治疗急性低血糖症的药物治疗，它可以在给药数分钟内恢复葡萄糖的正常水平。当胰高血糖素用于低血糖症的急性医疗处理时，将晶体形式的胰高血糖素溶解于弱酸缓冲液，并通过肌肉内注射该溶液。虽然该治疗是有效的，但方法很麻烦，且对于某些半昏迷状态的人员有危险。因此，需要这样一种胰高血糖素类似物，其保持母体分子的生物学表现但在相关的生理条件下具有足够的溶解性和稳定性，从而其可以预先配制为即用型注射溶液。另外，鼓励糖尿病患者维持接近正常的血糖水平以延迟或预防微血管并发症。该目标的实现通常需要强化胰岛素治疗。在努力达到该目标的过程中，医生曾遇到过他们的糖尿病患者中的低血糖症的频率和严重性显著升高的问题。因此，需要改善的药物和方法来治疗糖尿病，所述药物和方法相对于目前的胰岛素治疗而言，较不容易诱导低血糖症。如本文所述，提供了高效力的胰高血糖素激动剂，其在适合商用的药物组合物中在生理pH时具有升高的生物物理稳定性和水溶性。原始胰高血糖素在生理pH范围内既不可溶也不稳定，因此，其必须作为干燥产品生产，需要复原和立即使用。本文描述的胰高血糖素类似物具有增强的物理性质，这使其特别适合用于目前应用原始激素的目前的医疗环境中。根据一个实施方式，这些化合物可以用于制备用于治疗低血糖症的预先配制的即用型注射溶液。或者，胰高血糖素激动剂可以与胰岛素一起给药以缓冲胰岛素的效应，以便允许更稳定地维持血糖水平。另外，下文详细描述了包含本文公开的修饰的胰高血糖素肽的组合物的其它有益用途。
技术实现思路
本专利技术的一个实施方式提供了胰高血糖素肽，其保持胰高血糖素受体的活性并相对于原始胰高血糖素肽(SEQ ID NO:1)表现出改善的溶解性。原始胰高血糖素在水溶液中，特别是在生理pH时溶解性差，倾向于随时间发生聚集和沉淀。相反，相对于原始胰高血糖素，本专利技术的一个实施方式的胰高血糖素肽在25℃在6-8的pH，或6-9的pH，例如在pH为7时，在24小时后表现出至少2倍、5倍或更高的溶解性。在一个实施方式中，胰高血糖素肽保持原始胰高血糖素的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％的活性、80％的活性、85％的活性、或90％的活性(按照胰高血糖素肽的EC50相对于胰高血糖素的EC50的反比计算，例如使用大体上如实施例13中描述的测定法通过cAMP的产生来测定)。在一个实施方式中，本专利技术的胰高血糖素肽具有等于或大于胰高血糖素的活性(与本文的“效力”一词同义使用)。在一些实施方式中，胰高血糖素肽保持多达约100％、1000％、10,000％、100,000％或1,000,000％的原始胰高血糖素活性。胰高血糖素通常具有大约1％的原始GLP-1在GLP-1受体上的活性。GLP-1(7-36)酰胺(SEQ ID NO:57)或GLP-1(7-37)酸(SEQ ID NO:58)是GLP-1的生物学有效形式，它们在GLP-1受体上具有基本上相同的活性。相对于GLP-1受体，胰高血糖素对于胰高血糖素受体也具有10至20倍高的选择性(选择性按照胰高血糖素对于胰高血糖素受体的EC50相对于胰高血糖素对于GLP-1受体的EC50的反比计算)。例如，在某测定中，胰高血糖素对于胰高血糖素受体的EC50是0.22nM并且胰高血糖素对于GLP-1受体的EC50是3.85nM，则计算的选择性是17.5倍。可以通过例如使用大体上如实施例13描述的测定法通过cAMP的产生来测定活性。在一些实施方式中，本发明的胰高血糖素肽表现出小于大约5％、4％、3％、2％或1％的原始GLP-1在GLP-1受体上的活性，和/或相对于GLP-1受体而言，其对于胰高血糖素受体的选择性是大于约5倍、10倍、或15倍。例如，在一些实施方式中，本专利技术的胰高血糖素肽表现出小于5％的原始GLP-1在GLP-1受体上的活性，并且相对于GLP-1受体而言，其表现出对于胰高血糖素受体的大于5倍的选择性。本专利技术的任何胰高血糖素肽还可能另外表现出改善的稳定性和/或减少的降解，例如，在25℃在24小时后保持至少95％的初始肽。在一些实施方式中，本专利技术的胰高血糖素肽表现出改善的稳定性，从而在至少20℃(例如21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、至少27.5℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少50℃)以及小于100℃、小于85℃、小于75℃,小于或70℃的温度，在溶液中1周或更长时间(例如，2周、4周、1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肽，其包括：（i）氨基酸序列HSQGTFTSDYSKYLDAibRRAQDFVQWLMDE (SEQ ID NO: 76) 或（ii）具有1个、2个或3个修饰的EQ ID NO: 76， 其中所述肽包括在位置16的AIB、在位置28的Asp和在位置29的Glu且所述肽展示胰高血糖素激动剂活性。
【技术特征摘要】
2008.06.17 US 61/073193;2008.07.03 US 61/078165;201.一种肽，其包括：
（i）氨基酸序列HSQGTFTSDYSKYLDAibRRAQDFVQWLMDE (SEQ ID NO: 76) 或（ii）
具有1个、2个或3个修饰的EQ ID NO: 76，
其中所述肽包括在位置16的AIB、在位置28的Asp和在位置29的Glu且所述肽展示胰高血糖素激动剂活性。
2.权利要求1的肽，其中所述肽的位置1的氨基酸是D-组氨酸 (D-His)、去氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸、高组氨酸、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸或α,α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。
3.权利要求1的肽，其中所述肽的位置2的氨基酸是D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸或氨基异丁酸(AIB)。
4.权利要求3的肽，其中位置2的氨基酸是D-丝氨酸或AIB。
5.权利要求1的肽，其中位置20的氨基酸是是Ala、Ser或Thr。
6.权利要求1的肽，其中位置24的氨基酸是Ala、Ser或Thr。
7.权利要求1的肽，其包括氨基酸序列SEQ ID NO: 68。
8.包含通过接头连接的两个肽的二聚体，其中所述两个肽中至少一个是权利要求1-7中任一项的肽。
9....
【专利技术属性】
技术研发人员：RD迪马基，DL斯米利，M迪马基，J沙贝内，J戴，
申请(专利权)人：印第安纳大学研究及科技有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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