用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法和装置制造方法及图纸

本发明专利技术涉及用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法(100)。该方法(100)包括通过从样品中分离出靶细胞或伴随细胞来积聚样品的靶细胞的步骤(110)。该方法(100)也包括通过化学和/或物理裂解来消化靶细胞以制备包含靶细胞的核酸的靶细胞裂解产物的步骤(120)。该方法(100)还包含由靶细胞的裂解产物提纯核酸以提取靶细胞的核酸的步骤(130)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
本专利技术涉及用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法和用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的装置。本专利技术尤其涉及例如用于所谓的芯片实验室或口袋实验室(Lab-On-A-Chip)的微流体体系。在分子诊断中，经常需要检测样品中的病原体DNA或RNA。将由病原体，例如病毒或微生物，例如细菌或真菌获得的DNA或RNA称为病原体DNA或RNA。将样品尤其理解为是指血液样品，但原则上也可以是指其它液体或液化的患者样品，例如，尿、粪便、痰、脑脊液、灌洗液（Lavage）、冲洗过的抹片或液化的组织样品，特别是当它们包含血液或血液痕迹时。与此相关的病征例如是败血症。在疑似败血症的情况中，例如令人感兴趣的是，由血液检测病原体以及任选测定对某些抗生素的耐受性。由于病原体和白血球之间的浓度比，例如10-1000/ml对106-107/ml，在这种情况中，在样品中有很强的人DNA背景。商购可得的例如由血液中选择性提纯病原体的方法使用例如化学试剂，以首先实现选择性裂解人细胞。随后，酶促消化人核酸。然后例如通过离心分离或滗析上清液分离病原体。这种方法例如公开在DE102005009479A1中。US2010/0285578A1公开了由生物样品制备核酸的装置和方法。
技术实现思路
在此背景下，根据独立权利要求提供用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的改进的方法和用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的改进的装置。由各自的从属权利要求和下文中的描述得到有利的实施方案。根据本专利技术的实施方式可以实现尤其用于由也包含非病原体核酸的样品例如由血液细胞选择性制备病原体核酸的生物样品的处理。本专利技术的实施方式在这种情况下包括例如用于热预处理样品的方案和/或借助薄膜、微通道结构等用于处理样品的方案。因此，将选择性裂解伴随细胞的热预处理与酶促消化以及借助过滤的分离组合的目的尤其在于，由也包含伴随细胞的样品获得提纯的靶细胞-核酸。由此例如可想到的是由要检测病原体的存在的血液样品分离例如具有人DNA的白细胞。本专利技术的实施方式尤其可有利地用于在分子诊断中使用的体系或实验室例行程序中，或者可用于分子诊断中的微流体芯片实验室体系。本专利技术的实施方式可以有利地将含于样品中的靶细胞-核酸，例如病原体DNA，从伴随细胞-核酸，例如人DNA的背景中可靠地分离出来。由此避免伴随细胞核酸干扰随后的扩增-和检测步骤，并因此改善了检测和/或诊断的敏感性。在热预处理样品时可通过尤其是酶促消化可靠地避免例如在温度过高和/或预处理持续时间过长时会出现的样品胶凝。在此，样品的胶凝也可以考虑与胶凝相关的临界温度和持续时间取决于样品的性质例如红细胞比容来避免。通过例如酶促消化可以避免样品堵塞过滤器。由此甚至可以处理大的样品量。在此情况下，过滤能够由相对大的血液体积，例如1-10毫升，积聚仅少量的病原体，例如10-1000个。由此，可以提高靶细胞-核酸的有效浓度并使随后的扩增和检测变得容易。本专利技术的实施方式特别好地适用于自动化，特别是在微流体体系中。在这种情况下可容易地施行并且减少污染的风险。根据本专利技术的实施方式，可以由样品可靠地分离和浓缩靶细胞-核酸。由此可改进随后的扩增-和/或检测步骤的效率。相对于选择性化学裂解伴随细胞，根据本专利技术的分离伴随细胞提供了可使所需试剂和加工步骤的数量最小化的优点。由此也可缩短样品处理所需时间。此外，在提纯靶细胞-核酸方面的优点在于，根据本专利技术的实施方式可以以简单的方式整合在微流体体系，例如用于分子诊断的口袋实验室(LOC)中。也可提高可实现的靶细胞-核酸与伴随细胞-核酸的分离效果并可使所需过滤器或膜的数量最小。过滤尤其可以基于典型的细胞大小的不同，因此是普遍适用的。因此，不需要如同例如在基于抗体的方法的情况中那样针对特定的靶细胞进行调整。处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法具有下列步骤:通过从样品中分离靶细胞或伴随细胞来积聚样品的靶细胞；通过化学和/或物理裂解来分解靶细胞，以制备含有靶细胞-核酸的靶细胞裂解液；和由靶细胞-裂解液提纯核酸，以提取靶细胞的核酸。所述靶细胞可包括具有DNA和/或RNA作为核酸的病原体细胞或病原体，例如病毒或微生物，例如细菌或真菌。为简便起见，在下文中经常称为核酸，在此用其指称DNA和/或RNA。所述伴随细胞可包括人细胞，例如血液细胞等。样品尤其可以理解为是指血液样品，或者也可理解为是指另外的液体的或液化的患者样品，例如尿、粪便、痰、脑脊液、灌洗液、冲洗过的抹片或液化的组织样品，尤其是在其包含血液或痕量血液时。在提纯步骤中可提纯含于靶细胞-裂解液中的核酸并供入随后的分析中，通过其可验证特定病原体或基因，例如抗性基因的存在。所述随后的分析例如可通过测序、聚合酶链反应（PCR，聚合酶链式反应），实时PCR和/或在微阵列上检测或杂交进行。由样品提纯靶细胞-核酸可在分解或裂解靶细胞之后通过随后将靶细胞-核酸吸附在固相例如二氧化硅（Silika）过滤器或微粒或所谓的微珠上来进行。除了用于裂解的化学和酶促方法外，还存在机械方法，例如借助超声波或微球或微珠。提纯的目的是给随后的扩增和/或检测提供浓缩形式的靶细胞-核酸。在分离靶细胞-核酸与细胞碎片和蛋白质时也可以有利地使用本专利技术的实施方式。但是，尤其是人血样品会额外包含大量的带有人DNA的伴随细胞。分离靶细胞和伴随细胞的一种可能性可能在于，首先选择性分离或裂解含于样品中的伴随细胞，例如血细胞并与靶细胞分离。然后，可将靶细胞裂解并可提纯靶细胞-核酸。本专利技术的实施方式也可以将靶细胞-核酸与样品中存在的伴随细胞-核酸背景分离。否则，伴随细胞-核酸将干扰随后的靶细胞-核酸的扩增和分析，并且可能会使检测靶细胞的存在变得困难至不可能。因此，可防止伴随细胞-核酸在随后的扩增和分析中导致形成不希望的副产物并降低灵敏度。在相应的方法中，积聚步骤可具有将样品调温至裂解温度以分解和预先破坏伴随细胞的子步骤和借助过滤从样品中分离靶细胞的子步骤。根据一种实施方式，该积聚步骤可具有将样品温度调节到用于分解和预先破坏伴随细胞的裂解温度的子步骤，通过化学或酶促裂解来裂解在调温子步骤中被预先破坏的伴随细胞并通过酶消化由伴随细胞释放的核酸的子步骤和借助过滤由样品中分离靶细胞的子步骤。在此，可适当选择裂解温度，使含于样品中的伴随细胞被破坏或预先破坏，由此完整保留含于样品中的靶细胞。在分离子步骤中可借助积聚过滤器截留靶细胞。这样的实施方式提供了能实现特别有效而可靠地积聚靶细胞的优点。在此，由于不同的细胞壁状况可有针对性地使用热处理。由于裂解可防止过滤时的堵塞。在此，化学或酶促裂解和酶促消化子步骤可在调温子步骤之前、之中或之后进行。由此，可在裂解子步骤中降低样品的粘度。在这种情况中，尤其可在裂解和消化子步骤使用耐温的酶，例如核酸酶、蛋白酶或溶菌酶。这样的实施方式提供了这样的优点，即由此在热预处理期间已经可以可靠地避免样品胶凝。或者，本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法(100)，其中所述方法(100)具有下述步骤：通过从样品中分离靶细胞或伴随细胞积聚(110)样品的靶细胞；通过化学和/或物理裂解分解(120)靶细胞，以制备含有靶细胞的核酸的靶细胞‑裂解液；和由所述靶细胞‑裂解液提纯(130)核酸，以提取靶细胞的核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.07 DE 102013215575.11.用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的方法(100)，其中所述方法(100)具有下述步骤：
通过从样品中分离靶细胞或伴随细胞积聚(110)样品的靶细胞；
通过化学和/或物理裂解分解(120)靶细胞，以制备含有靶细胞的核酸的靶细胞-裂解液；和
由所述靶细胞-裂解液提纯(130)核酸，以提取靶细胞的核酸。
2.根据权利要求1的方法(100)，其中积聚步骤(110)具有将样品温度调节到裂解温度以分解和预先破坏伴随细胞的子步骤、通过化学或酶促裂解来裂解在调温子步骤中被预先破坏的伴随细胞和酶促消化由伴随细胞释放的核酸的子步骤和借助过滤从样品中分离靶细胞的子步骤。
3.根据权利要求2的方法(100)，其中所述裂解和消化子步骤在调温子步骤之前、之中或之后进行，其中在裂解子步骤中降低样品的粘度。
4.根据权利要求1的方法(100)，其中在积聚步骤(110)中借助至少一次过滤从样品中分离伴随细胞。
5.根据权利要求1或4的方法(100)，其中在积聚步骤(110)中，冲洗样品通过多个串联的分离装置(620;1220,1325;1420,1525)以分离伴随细胞。
6.根据权利要求1、4或5之一的方法(100)，其中在积聚步骤(110)中，冲洗样品多次通过一个分离装置(620;1220,1325;1420,1525)以分离裂解的伴随细胞，其中在伴随细胞的冲洗过程之间清洁所述分离装置(620;1220,1325;1420,1525)。
7.根据前述权利要求之一的方法(100)，其中积聚步骤(110)具有稀释样品的子步骤。
8.根据前述权利要求之一的方法(100)，其中在分解靶细胞的步骤(120)中借助裂解缓冲液和/或借助超声波耦合分解靶细胞。
9.用于处理包含靶细胞和伴随细胞的生物材料样品以提取靶细胞的核酸的装置(200)，其中所述装置(200)具有下述特征：
通过从样品中分离靶细胞或伴随细胞来积聚样品的靶细胞的装置(210,220,230,240;315,320;620,630;725;950,964;1220,1325;1420,1525)；
通过化学和/或物理裂解来分解靶细胞以制备含有靶细胞的核酸的靶细胞-裂解液的装置(240,260;630,662)；和
...

【专利技术属性】
技术研发人员：B法尔廷，F莱尔默，S贝宁，C多雷尔，
申请(专利权)人：罗伯特·博世有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE