用于将DNA导入靶细胞的筛选方法技术

本发明专利技术提供了将多核苷酸导入靶细胞的方法，其中该方法使用发光蛋白编码序列作为报道基因。本文所述方法的一个重要优点是可有效地转化药物抗性靶细胞或不具有有用的营养缺陷型标记的靶细胞。本发明专利技术也包括由本文所述方法产生的转化细胞。还描述了发光蛋白编码序列修饰、各种载体和使用本发明专利技术转化细胞的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及用于检测任何靶细胞或生物体的组合物和方法，靶细胞或生物体用外源核酸转化而不需要可选择的标记。这些组合物和方法使DNA导入任何可转化的细胞类型并随后使用这些细胞用于高通量筛选药物或其它化合物。专利技术的背景迅速和有效鉴制成功地用外源DNA转化的细胞的测定在多种应用中有用，包括例如鉴别细胞系和/或转基因生物体和进行高通量药物筛选。确实，仅有一次外源DNA的插入证实细胞系或转基因生物体可作为动物模型用于药物发现、阐明生化途径、毒性研究等。最普遍使用的检测外源核酸是否导入靶细胞的方法是用选择，或通过由导入DNA补充的营养缺陷或通过药物抗性。为补充营养缺陷型突变体，受体细胞必须缺乏此基因功能。为了药物抗性，细胞必须对药物敏感。不幸的是，许多细胞(如病原体)对药物选择技术有抗性。例如白色念珠菌(Candida albicans)显示对潮霉素、苯菌灵、放线酮、丝裂霉素C和衣霉素的抗性。类似的，其它致病生物(如二甲氧基苯青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)和一些结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的变种)对许多这些常规使用的抗生素产生抗性。因此，转化这些细胞并检测到成功的整合被证明是非常困难的。二甲氧基苯青霉素抗性的金黄色葡萄球菌菌株(MRSA)是世界上最普遍的医院病原体。在美国大的教学医院中超过40％医院产生的葡萄球菌感染是由MRSA引起的。它们在较小的医院(200到500病床的医院中发生率为20％)及在疗养院中变得普遍(Wenzel等.，1992，Am.J.Med 91(Supp 3B)221-227)。MRSA菌株不寻常的性质是它们获得其它抗性因子的能力，这种能力导致这些菌株对化学疗法上有用的抗生素敏感性很小或没有。现在这种多抗性细菌菌株在全世界普遍，且这些病原体中最厉害的携带对所有可用的抗菌剂的抗性机制，除了一种抗菌剂(即万古霉素)(Blumberg等.，1991，J.Inf.Disease(631279-1285))。另一种医院病原体粪肠球菌(Enterococcus faecium)因其从一个细胞转移至另一个携带质粒的抗性因子的能力而众所周知，如万古霉素抗性。这种抗性因子转移机制会导致越来越多对已知抗生素的细菌抗性。粪肠球菌的高水平万古霉素抗性菌株1986年在英格兰首次分离。在20世纪90年代，文献记录万古霉素抗性肠球菌(VRE)已传播到全世界。鉴定抗高浓度氨苄青霉素或庆大霉素或抗万古霉素的多药物抗性菌株产生严重的治疗难题。此外，缺乏对抗生素的敏感性极大地干扰操作这些生物体的能力，尤其是考虑到大部分细菌转化载体依赖于抗生素抗性选择。对抗生素抗性的基础和抗性菌株的出现更完全的解释可在文献中发现(如美国专利6,136,587 Tomasz等.，2000年10月24日；Ohno，A等.，NipponRinsho(2001)59(4)673-680)。某些生物体中缺乏有效筛选系统可严重削弱筛选候选药物的努力。部分由于免疫减弱的病人数目上升，感染药物抗性生物和通常良性生物的全身性真菌感染增加，例如许多这种感染起因于正常人体菌群白色念珠菌。假丝酵母种现在是医院血流感染的第四种最普遍的原因(Edmond等.，(1999)Clin InfectDis.29(2)239-44)。与患严重假丝酵母感染的人数上升相当的是抗真菌化合物抗性菌株发挥的增加(White，Marr等.，(1998)Clin Microbiol Rev 11(2)382-402)。为与此抵消，必须研究新种类的抗真菌化合物和它们可能的靶。使用遗传方法研究白色念珠菌中适合于抗真菌攻击的新靶已受到一些因素的阻碍。首先用白色念珠菌的质粒通常作为随机拷贝存在于细胞中且在没有选择压力的情况下迅速丢失(Cannon等.，(1992)Mol Gen Genet.235(2-3)453457；Kurtz等.(1987)Mol Cell Biol.7(1)209-17；Pla等.(1995)Gene 165(1)115-20)。此外，不像酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，没有着丝粒序列或自主复制序列被克隆，使游离型质粒在没有任何选择的情况下维持。另一个阻碍研究白色念珠菌和产生有效处理的因素是，此生物被认为是其整个生命周期中的二倍体。直到最近显示假丝酵母可强制交配(Magee(2000)Science289(5477)310-313；Hull等.(2000)Science 289(5477)310-310)，可能经历四倍体阶段。存在类似于酿酒酵母交配等位基因的遗传因子表明减数分裂可导致单倍体细胞，然而没有观察到这种单倍体分离的。因此，为研究一种新的抗真菌靶，候选基因的染色体拷贝必须失活以观察其对细胞的作用。为敲除两个拷贝，发展了一个称为“ura blaster”的构建物(Alani(1987)Genetics 117(1)5-12；Fonzi等.(1993)Genetics 134(3)717-28)。必须使细胞是URA3营养缺陷型，从临床分离的产生营养缺陷型菌株通常显著减小毒性或完全去除(Lay等.(1998)InfectImmun.66(11)5301-6；Kirsch等.(1991)Infect Immun.59(9)3297-300；Polak(1992)Mycoses 35(1-2)9-16；Cole等.(1995) FEMS Microbiol Lett.126(2)177-80)。研究显示即使在强毒株中，恢复URA3功能未必使毒性恢复到野生型水平(Lay等.(1998)，同前)。第三个因素是极少数异源基因已在白色念珠菌中表达，这是由于其异常的密码子使用(CTG编码丝氨酸而不是亮氨酸)(Leuker(1994)Mol Gen Genet.245(2)212-7)。为使异源基因在白色念珠菌中功能性表达，基因中每个CTG密码子必须突变成其它亮氨酸密码子(Morschhauser等.(1998)Mol Gen Genet.257(4)412-20)。因此，这些和其它困难限制了假丝酵母基因对URA3或其它营养标记敲除的菌株的研究。许多报道基因由于诱变它们用于表达所需的努力而不使用。美国专利5,650.135所述方法，有可能在活动物中检测生物发光细菌，而不需解剖或其它方式打开动物(“体内监控”)-用高灵敏照相机通过肌肉、皮肤、毛皮和其它传统上“不透明”组织检测光。尽管绿色荧光蛋白(GFP)在白色念珠菌中表达(Cormack，Bertram等.，(1997)Microbiology 143(Pt2)303-11；Morschhauser，Michel等.，(1998)Mol Gen Genet.257(4)412-20)，产生GFP的白色念珠菌细胞尚未在活动物体内发现。Srikantha等.，((1996)J Bacteriol.178(1)121-9)报道海洋三色堇肾脏形肾海鳃(Renilla reniformis)的荧光素酶在白色念珠菌中表达，但底物coelentrazine的成本使它在活动物中使用不现实。除了白色念珠菌，许多其它致病生物对大部分或所有抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将多核苷酸导入细胞的方法，其特征在于，所述方法包括提供细胞群体；在有利于至少一个细胞吸亚群收多核苷酸的条件下，用多核苷酸处理所述细胞群体，其中所述多核苷酸包括发光蛋白编码序列；筛选所述细胞群体中的产光细胞；　 　分离产生光的细胞，其中能产生光的细胞是多核苷酸导入其中的细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：KP弗朗西斯，TC多伊尔，KA纳沃特卡，
申请(专利权)人：荧合金股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]