产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母及其筛选方法技术

通过如下步骤对具有减弱的谷胱甘肽合成酶活性且能够产生γ－谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株进行了筛选：（ａ）从大量酵母中选择对限定范围浓度的ＭＮＮＧ耐受的酵母菌株；和（ｂ）从这样选择的菌株中选择具有减弱的谷胱甘肽合成酶活性且能够产生γ－谷氨酰半胱氨酸的菌株。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株、筛选该酵母菌株的方法及利用该酵母菌株细胞的食品。从其中产生的γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸可用于食品领域中。
技术介绍
半胱氨酸是为了增强食品的味道等目的而应用的。已知的半胱氨酸生产方法包括如蛋白质酶解方法和半合成的方法。目前应用的方法大体上是蛋白酶解方法和半合成的方法。尽管为了应用它们以增强食品味道的目的而需要具有高半胱氨酸含量的天然食品材料，但很少这种天然食品材料是已知的。另一方面，人们已报道对含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母提取物的热-或酶-处理可导致具有高半胱氨酸含量的食品材料(WO 00/30474)。γ-谷氨酰半胱氨酸通过γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的功能从作为底物的半胱氨酸和谷氨酸合成。另一方面，谷胱甘肽通过谷胱甘肽合成酶的功能从作为底物的γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成。人们已报道谷胱甘肽合成酶基因被破坏的酵母可累积γ-谷氨酰半胱氨酸(Otake，Y.等人，Agric.Biol.Chem.，54(12)，3145-3150，1990)。作为筛选已丧失谷胱甘肽合成酶活性的酵母的方法，应用甲基乙二醛敏感性作为表型的方法是已知的(Otake，Y.等人，Agric.Biol.Chem.，54(12)，3145-3150，1990)。根据该报道，从300个甲基乙二醛敏感性菌株中选择了12个不能产生谷胱甘肽的菌株。该报道进一步陈述进一步的分析显示8个菌株是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶突变型，而剩余的4个是谷胱甘肽合成酶突变型。在该筛选方法中，75个甲基乙二醛敏感性菌株中有1个菌株是谷胱甘肽合成酶活性的突变型。因此，粗略地看，该方法似乎是γ-谷氨酰半胱氨酸高累积性酵母的简单筛选方法。然而，由于对从中选择出上述300个甲基乙二醛敏感性酵母的菌株的数目未作描述，所以应用甲基乙二醛敏感性作为表型的筛选方法不能认为是含有高γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母的简单筛选方法。此外，在将甲基乙二醛敏感性用作表型的情形中，需要困难的复制操作。从此观点看，根本不能认为这是简单的筛选方法。附带地，已知利用MNNG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)抗性的方法是筛选谷胱甘肽缺陷型菌株的方法(Kistler，M等人，MutationResearch，173(1986)117-120；Kistler，M等人，Mutagenesis，5(1)39-44，1990)。根据该方法，所有获得的酵母均丧失了γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性，但未获得具有降低的谷胱甘肽合成酶活性的菌株。已知利用硝普酸钠的方法是筛选谷胱甘肽缺陷型菌株的另一种方法。据报道同样在该情形中，获得的酵母均是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶突变型(Kistler，M等人，Mutagenesis，5(1)39-44，1990)。专利技术公开在上述技术背景中，本专利技术的一个目的是提供具有降低的谷胱甘肽合成酶活性并产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母，和这种酵母的简单筛选方法以及利用这种酵母菌株的含有γ-谷氨酰半胱氨酸的食品。在这些情况下，本专利技术者已进行了大量研究，且作为结果，他们已发现对用作表型的一定浓度MNNG的抗性使得能够对具有降低的谷胱甘肽合成酶活性且具有γ-谷氨酰半胱氨酸生产力的菌株进行选择，因此实现了本专利技术。即，本专利技术如下。(1)一种对MNNG具有抗性且产生γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株。(2)根据(1)的酵母菌株，其中该菌株具有如下面公式计算的0.03或更大的生长程度生长程度＝当培养于含MNNG的培养基中时培养基的OD660/当培养于不含MNNG的培养基中时培养基的OD660 当收集在液体培养基中预先培养的酵母菌株并将其接种于含有30μg/ml MNNG的YPD培养基(含MNNG的培养基)和不含MNNG的YPD培养基(不含MNNG的培养基)中，使每一种培养基在660nm的吸收(OD660)为0.1，然后将该菌株在适当的温度进行固定培养(standing culture)的时候。(3)一种根据(1)或(2)的酵母菌株，其中该菌株具有降低的谷胱甘肽合成酶活性。(4)一种根据(1)～(3)中任何一项的酵母菌株，其中当培养于SD培养基中时，对数生长期中每个干细胞的γ-谷氨酰半胱氨酸含量按重量计算为1％或更多。(5)一种根据(1)～(4)中任何一项的酵母菌株，其中该菌株具有二倍性或更多倍性。(6)一种根据(1)～(5)中任何一项的酵母菌株，其中该菌株属于酵母属(Saccharomyces)。(7)一种筛选具有对MNNG的抗性和γ-谷氨酰半胱氨酸生产力的酵母菌株的方法，该方法包括步骤(a)从大量酵母中选择对一定浓度范围的MNNG有抗性的酵母菌株；和(b)从选择的菌株中筛选具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰半胱氨酸生产力的菌株。(8)一种根据(7)的方法，其中在步骤(a)中，大量酵母是通过将亲代酵母菌株进行突变处理而制备的。(9)一种根据(7)或(8)的方法，其中在步骤(a)中，对一定浓度范围的MNNG有抗性的酵母菌株是用琼脂培养基进行选择的，在该培养基上已形成了MNNG的浓度梯度。(10)一种根据(7)～(9)中任何一项的方法，其中在步骤(a)中，提供了以前分离的具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰半胱氨酸生产力的酵母模型菌株，并选择了与模型菌株有相同水平的对MNNG的抗性的酵母菌株。(11)一种包括通过在适当条件下培养根据(1)～(6)中任何一项的酵母菌株获得的培养物的食品或饮料，或者含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培养物的分级分离产物，或者在其中已通过热处理而产生半胱氨酸的培养物或分级分离产物。(12)一种根据(11)的食品或饮料，其中该食品或饮料是含酒精的饮料、面包食品或发酵的食品调味品。(13)一种应用培养物产生的酵母提取物，所述培养物通过在适当条件下培养根据(1)～(6)中任何一项的酵母获得。(14)一种生产含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的食品的方法，该方法包含以下步骤培养根据(1)～(6)中任何一项的酵母菌株，将获得的培养物或其分级分离产物，或者进行了热处理的培养物或其分级分离产物，与饮料或食品原材料混合，并将该混合物加工为食品或饮料。在下文中将对本专利技术进行详细描述。本专利技术的酵母菌株是对MNNG有抗性且可产生γ-谷氨酰半胱氨酸的菌株。在本专利技术中，“对MNNG有抗性”指在一定浓度MNNG存在时显示比野生菌株更好的生长。然而，并不需要在存在和不存在MNNG时显示相同程度的生长。换句话说，如果在存在MNNG时其生长比野生菌株的生长更好，那么尽管与不存在MNNG时相比在存在MNNG时生长不佳，都认为该菌株具有MNNG抗性。一般地，“对MNNG有抗性”指当收集在液体培养基中预先培养的酵母菌株并将其接种于含有30μg/ml MNNG的YPD培养基(含MNNG的培养基)和不含MNNG的YPD培养基(不含MNNG的培养基)中，从而每一种培养基在660nm的吸收(OD660)为0.1，并然后将该菌株在适当的温度进行固定培养时，由如下公式计算的生长程度为0.03或更大，优选地为0.04或更大，更优选地为0.05或更大。生长程度＝当培养于含MNNG的培养基中时培养基的OD660/当培养于不含MNNG的培养基中时培养基的OD660此外，人们认为生长程度为0.01本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对ＭＮＮＧ具有抗性且产生γ－谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：西内博章，末广真理子，杉本玲子，西村康史，黑田素央，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]